miR-29b和Tiam1在结肠癌中的表达及其临床意义*

舒 若，田 衍，曾玉剑，罗华友，李 颖

(昆明医科大学第一附属医院胃肠与疝外科，昆明 650032)

结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，每年约有600 000例患者死于结肠癌[1-2]。尽管在诊断和治疗上取得重大进展，但结肠癌的病死率仍然很高[3]。转移是恶性肿瘤的主要生物学行为，也是影响治疗效果和预后的主要原因之一[4-5]。许多研究表明，microRNA在癌症进展和转移中发挥重要作用[6-7]。microRNA是一类片段小的非编码RNA，能够通过抑制翻译而减少特定靶基因的表达[8-10]。其中相关研究报道MicroRNA-29b (miR-29b)在结肠癌中低表达，并在癌症转移中发挥重要作用[11-12]。同时发现T淋巴瘤浸润转移诱导因子1(T lymphoma invasion and metastasis including factor 1,Tiam1)是一个鸟嘌呤核苷酸交换因子，能够选择性地激活类似Rho GTP酶[13]，在结肠癌中高表达，并且在癌症转移中起着至关重要的作用[14-15]。生物信息学和分子生物学实验表明miR-29b可与Tiam1 mRNA的3′-UTR结合，直接抑制癌细胞中Tiam1的转录后表达，提示miR-29b可能Tiam1的直接靶基因[16]。但目前综合分析miR-29b和Tiam1在结肠癌的表达及其意义鲜有报道。本研究通过检测结肠癌组织和癌旁组织中miR-29b、Tiam1 mRNA表达，分析二者相关性，并且观察它们与结肠癌病理特征的关系，以探讨结肠癌的发病机制和发现潜在的药物治疗靶点。

表1 基因引物序列

1 资料与方法

1.1一般资料 收集本院2015年6月至2017年3月手术切除的结肠癌组织标本及癌旁正常组织(距离癌组织大于5 cm)，手术切除的新鲜标本置于-80 ℃冰箱保存。标本共计30例，其中男16例，女14例；年龄42～80岁，平均(66.87±8.13)岁。参考全国结直肠癌协作组结直肠癌诊治规范及AJCC/UICC的TNM分期标准对结肠癌组织进行诊断和分期(Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅱ～Ⅳ期12例)[17]。所有受试者均已签署知情同意书，本研究通过本院伦理委员会审批通过。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR法检测miR-29b、Tiam1 mRNA表达水平 提取总RNA:按照Trizol试剂说明书取约50 mg组织提取总RNA，RNase-Free H2O溶解RNA，微量分光光度计检测RNA浓度及纯度，然后反转录合成cDNA，-80 ℃保存备用。采用Taqman RT-PCR kit进行PCR扩增，检测miR-29b以U6为内参基因，检测Tiam1 mRNA表达水平以GAPDH为内参基因。反应体系在ABIQ6型实时荧光定量PCR仪上进行，测定每个样品的Ct值。基因的表达以相对含量=2-△△Ct的形式呈现。基因引物序列见表1。

1.2.2蛋白免疫印迹检测Tiam1的表达 分别取约250 mgⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的结肠癌组织加入RIPA lysis buffer提取总蛋白。然后将各样品放入4 ℃离心机中12 000 g离心15 min，收集上清液。利用BCA protein assay kit确定蛋白浓度。为了检测Tiam1在不同分期结肠癌组织中的表达，各取80 μg的蛋白在15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，75 V下反应2 h，然后转聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。向PVDF膜加入Tiam1一抗(Abcam)在4 ℃过夜孵育后，再加入二抗孵育2 h，最后加入电化学发光(ECL)发光液在Alpha Innotech曝光成像分析。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参蛋白。

1.2.3观察指标 记录并统计所有参与者临床分期和是否出现淋巴结转移。

2 结 果

2.1miR-29b与Tiam1 mRNA的表达 miR-29b在结肠癌组织(0.50±0.27)比其在癌旁组织(1.00±0.00)中的表达低，差异有统计学意义(P<0.05)，而Tiam1 mRNA在结肠癌组织(4.22±2.13)比其在癌旁组织(1.00±0.00)中的表达高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2miR-29b与Tiam1 mRNA的相关性分析 将miR-29b与Tiam1 mRNA在结肠癌组织与癌旁组织中的表达进行相关性分析，结果显示二者表达呈显著负相关(r=-0.869，P<0.01)，见图1。

图1 miR-29b与Tiam1 mRNA表达的相关性

2.3miR-29b、Tiam1 mRNA表达与结肠癌主要临床病理特征的关系 在不同临床分期中，miR-29b和Tiam1 mRNA的表达水平表现出不同的趋势。随着临床分期的进展，miR-29b表达呈下降的趋势，其中Ⅲ期、Ⅳ期结肠癌组织中miR-29b的相对表达量为0.23±0.08，明显低于Ⅰ期和Ⅱ期结肠癌(0.69±0.18，P<0.05)。随着临床分期的进展，Tiam1 mRNA表达呈上升的趋势，其中Ⅲ期、Ⅳ期结肠癌组织中Tiam1 mRNA的相对表达量为6.10±1.86，明显高于Ⅰ期和Ⅱ期结肠癌(2.97±1.15，P<0.05)。并且利用蛋白免疫印迹检测Tiam1在不同分期结肠癌组织中的蛋白表达也显示Ⅲ期、Ⅳ期结肠癌组织中Tiam1蛋白的相对表达量明显高于Ⅰ期和Ⅱ期结肠癌组织中的表达(图2)。另外，miR-29b和Tiam1 mRNA表达还显示出与淋巴结转移的密切联系，miR-29b在有淋巴结转移结肠癌组织的表达明显低于无淋巴结转移者(P<0.05)，而有淋巴结转移结肠癌组织中Tiam1 mRNA表达水平明显高于无淋巴结转移者(P<0.05)，见表2。

图2 Tiam1蛋白在不同分期结肠癌组织中的表达

表2 miR-29b、Tiam1 mRNA表达水平与结肠癌临床病理特征的关系

3 讨 论

结肠癌的发生是一个多因素、多阶段和多基因改变协同作用的过程，其发生的分子基础包括癌基因和抑癌基因的表达失调[18]。研究结肠癌的发病机制，如分子遗传学和生物学的改变，在将来有希望能够改善患者的预后。但是，不幸的是，大多数患者死于其转移性[19]。因此，研究结肠癌的发生和转移都尤为重要。

最近几年，许多研究表明microRNAs通过绑定不同的mRNAs在肿瘤发生和转移中发挥重要作用[20]。到目前为止，在结肠癌中已有许多异常表达的microRNAs，如miR-21、miR-124和miR-29b等，并且这些microRNAs在结肠癌的发生和进程中起着至关重要的作用[21-23]。本研究对30例结肠癌组织和癌旁正常组织研究发现，结肠癌组织中miR-29b表达下降，同时Tiam1过表达，二者呈显著负相关。结合相关文献报道及生物信息学分析，推测肠道正常组织miR-29b对Tiam1的表达呈负向调控。在各种致瘤因子的刺激下，miR-29b对Tiam1的负向调控相对较弱，从而使Tiam1的表达在病理状态下增加，影响肿瘤的微环境，从而进一步诱导和促进肿瘤细胞的转移。本研究发现，与癌旁正常组织相比，Tiam1在结肠癌组织中的表达升高，并且TNM分期Ⅰ和Ⅱ期结肠癌组织中miR-29b的表达水平明显高于Ⅲ和Ⅳ期结肠癌(P<0.05)，而TNM分期Ⅰ～Ⅳ期结肠癌组织中Tiam1表达有上升趋势，即Ⅰ和Ⅱ期结肠癌组织中Tiam1 mRNA的表达水平明显低于Ⅲ和Ⅳ期结肠癌(P<0.05)。该结果说明miR-29b和Tiam1可能成为结肠癌临床分期的指标。另外，miR-29b在有淋巴结转移结肠癌组织的表达明显低于无淋巴结转移者，Tiam1 mRNA表达与其相反。LIU等[14]研究发现Tiam1在转移性结肠癌细胞系(LoVo和SW620)中的表达明显高于原发性结肠癌细胞系(LS174T,SW480，HCT116，LST，HRT和Hee8693)的表达，这说明Tiam1基因与转移性结肠癌密切相关。WANG等[16]还发现miR-29b能够通过下调Tiam1和抑制上皮间质转分化从而抑制结肠癌细胞的生长和转移。

本文结果提示结肠癌中miR-29b表达下降并且伴随Tiam1表达上调可能是结肠癌的发病机制之一，miR-29b和Tiam1可以成为结肠癌潜在的诊断标志物。