鸡新城疫诊断抗原制备方法的研究

詹丽娥　陆冰洋　刘华栋　李婷婷　唐娟　王彩先　丁树荣

摘要：将疑似新城疫病料无菌采集后进行RT-PCR鉴定，将阳性病料研磨后接种SPF鸡胚，收获的阳性尿囊液进行血凝试验（HA）及血凝抑制试验（H1）检测病毒效价，病毒效价达到2⁷～2⁸，病毒凝集效价达到10log2。使用10%蔗糖溶液及18-25kDa透析袋对阳性尿囊液进行浓缩，浓缩至原体积的1/5；10%福尔马林灭活诊断抗原，经过6h后灭活达100%；诊断抗原效价测定：血凝效价为2¹⁰；血凝抑制效价为10log2。利用制备的鸡新城疫诊断抗原和鸡新城疫标准诊断抗原与鸡新城疫标准检测抗体进行血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HI），对比结果：鸡新城疫诊断抗原病毒效价为2¹⁰，高于鸡新城疫标准诊断抗原的2。，鸡新城疫诊断抗原凝集效价为10log2，等同于鸡新城疫标准诊断抗原，证明所制备鸡新城疫诊断抗原符合要求，可以应用到生产实践中。

关键词：新城疫，RT-PCR，抗原检测，抗原制备，抗体检测

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。病鸡是本病的主要传染源，感染后临床症状主要表现为：呼吸困难，拉绿色稀便，精神沉郁，个别出现转圈的神经症状。病毒存在于病鸡所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中。在流行间歇期的带毒鸡也是本病的传染源，病毒可经消化道、呼吸道、眼结膜、受伤的皮肤和泄殖腔黏膜侵入机体。该病一年四季均可发生，以春秋季较多，鸡群一旦发生本病可于4-5d内波及全群，具有极高的发病率和病死率，是危害养禽业的主要传染病之一。世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类疫病，我国列入重大传染病，也是禽类重点防控的传染病之一。

目前对鸡城新城的主要防控措施有以下几种：1）新城疫疫苗预防，我国已将新城疫的免疫列入各养鸡场的免疫程序；2）采取分子生物学方法和免疫学方法进行流行病学调查，做到早发现、早诊断、早治疗，将易感鸡提前扑杀，控制易感鸡群感染。可以快速、简便诊断新城疫，易于基层兽医站工作人员和鸡场化验员掌握，血凝试验和血凝抑制试验均需要新城疫诊断抗原，本项目对新城疫诊断抗原的制备方法进行研究，采用血清学方法对鸡群进行流行病学调查，达到了早发现、早诊断、早治疗控制NDV传播与流行的目的。

1.材料和方法

1.1病料

新城疫病料组织无菌采自山西太原、晋中、吕梁等地疑似发病鸡场。

1.2主要试剂及材料

新城疫标准阳性血清购自中国兽医药品监察所；新城疫标准阳性抗原购自哈尔滨维科生物技术开发公司新城疫病毒通用型RT-PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；dNTP（2.5mmol/Leach）、AMV、RNaseInhibitor、6^*Ioadinq Buffer、RT-PCRKit购自宝生物工程（大连）有限公司；Trizol购自Invitrogen公司引物由华大基因公司合成；即用型透析袋18-25kDa RC膜S/P购自美国光谱医学；其他试剂均为国产分析纯试剂；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.3主要仪器

4℃冷冻离心机（型号为Neofuge 13R），购自HealForce公司；分光光度计（型号为BioPhotometer），购自Eppendorf公司；电热恒温水浴锅（型号为HHS型），购自天津市华北实验仪器有限公司；BIOER基因扩增仪（型号为G1000），购自杭州博日科技有限公司；电泳仪（型号为GEI00），购自MiniRun公司；凝胶成像系统（型号为Imageouant300），购自GE Healthcare公司；超净台，购自北京半导体一厂。

1.4引物设计与合成

参考新城疫诊断技术GB/T16550-2008中RT-PCR通用引物，引物序列（表1）：

1.5病料的处理

将采集到的16份疑似新城疫病料按OIE手册中诊断与疫苗标准部分关于新城疫病毒处理的标准方法进行，具体方法为：将冻存的病料融化后剪碎，放入研磨器中，加入灭菌PBS研磨并加入青链霉素终浓度为1mg/mL，得到的悬浊液加入等体积氯仿，充分震荡后置于4℃过夜，12，000rpm离心15min将上清移入灭菌的EP管中备用。

1.6疑似病料RNA的提取及RT-PCR检测

分别取1.4处理后的上清液100μL于EP管内，加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，室温静置3～5min；将液体吸入吸附柱中，13，000rpm离心30s；弃去收集管中液体，加入600μL洗液，13，000rpm离心30s，重复该步骤一次；弃去收集管中液体，13，000rpm空柱离心2min；将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，向柱中央加入洗脱液50μL，室温静置1min，13，000rpm离心30s，离心管中液体即为模板RNA。

RT-PCR总体积为20μL，加入16.8μL RT-PCR反应液，1.2μL酶混合液，加提取的RNA2μL。反应条件：42℃45min，94℃3min；循环94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35次；再72℃延伸7min。

1.7SPF鸡胚培养

将1.4中处理后的阳性病料上清液100μL超净台无菌接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔，37℃培养24h后将死亡SPF鸡胚取出，72h后无菌取尿囊液，连传三代。

1.8阳性病料PCR检测

参照RNA常规提取方法，取1.7中阳性病毒样品250μL，加Trizol 750μL，剧烈振荡15s，靜置5min；加500μL氯仿，混匀，静置5min，4℃、12，000r/min离心15min；取上清液加等体积异丙醇，混匀，液氮沉降20min，取出室温融化后，4℃、12，000r/min离心20min；弃上清液，加-20℃75%乙醇1mL，静置15s，倒掉，重复一次；超净台风干后，加20μL DEPC水溶解RNA，分光光度计检测RNA含量，-80℃保存，备用。

RT-PCR反应体系（表2）。

反应条件：反转录42℃45min；预变性95℃3a‘iR；94℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环；终延伸72℃10min。产物进行电泳。

1.9病毒效价检测与凝集价检测

通过血凝试验（HA）检测新城疫病毒效价：取96孔板，每孔加50μL PBS；第——孔加50μL阳性尿囊液混匀，抽取第一孔50μL混合液加入第二孔，依次将阳性尿囊液进行2^-1～2^-12稀释，第十二孔混匀后弃去50μL；然后在每孔加入50μL 1%鸡红细胞，震荡器震荡1min混匀，放入37℃恒温箱20min进行反应。

通过血凝抑制试验（H1）检测新城疫病毒凝集价：根据1.9血凝试验结果，将新城疫阳性尿囊液按照血凝滴度配制成4个血凝单位抗原；取96孔板，在第1～11孔加入0.025μL PBS，第12孔加入0.05μL PBS；在第1孔加入0.025μL标准阳性血清混匀，然后从第1孔吸出0.025μL液体加入第2孔，依次加至第10孔，第11孔为阳性对照，第12孔为阴性PBS对照；在第1～11孔加入0.025μL 4HAU抗原；每孔加入0.025μL 1%鸡血细胞悬液，震荡混匀，放37℃恒温箱20min后，当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果。

1.10阳性诊断抗原浓缩与灭活

取SPF鸡胚繁殖病毒阳性尿囊液50mL加入透吸袋里，透吸袋两头用医用止血钳挟住，将500mL10%的蔗糖溶液倒入搪瓷盘里铺开，放入装有50mL病毒尿囊液的透吸袋，根据渗透压差的方向，10%的蔗糖溶液将水分从50mL病毒尿囊液透析袋里析出，当透析袋里的阳性病毒尿囊液体积达到10-15mL即可停止浓缩；用移液枪将透析袋里的阳性病毒尿囊液吸入无菌瓶里，-20℃冻存备用。

浓缩的阳性病毒尿囊液用10%福尔马林灭活，100mL阳性病毒尿囊液中加入0.2mL福尔马林摇匀，1h后放入20℃备用。取灭活后的阳性病毒尿囊液接种9日龄SPF鸡胚，72h后收尿囊液进行RNA提取并进行RT-PCR，方法如1.8。

1.11浓缩阳性诊断抗原效价测定

参考新城疫诊断技术GB/T16550-2008中血凝试验（HA）和血凝抑制试验（H1）方法，使用标准阳性血清检测浓缩阳性诊断抗原效价，并与新城疫标准诊断抗原进行对比。

2结果与分析

2.1疑似病料RNA的提取及RT-PCR检测

16份疑似病料中经过RNA提取和RT-PCR反应，取PCR产物5μL+6×loading Buffer 2μL，加样于1%琼脂糖凝胶中。电泳条件：电压100V，时间20min。

检测疑似新城疫病料共计16份（结果如图1），检出4份，阳性率为25%。

2.2SPF鸡胚培养

4份阳性病料，每份第一代接种5枚，第二代接种5枚，第三代接种30枚。接种情况（如表3）：

2.3阳性病料PCR检测

对所得4份阳性病料进行RT-PCR检验，均为阳性（如图2）。

2.4病毒效价检测与凝集价检测

阳性病料尿囊液通过血凝试验（HA）分别达到2⁸、2⁷、2⁷、2⁸，符合预期。

阳性病料尿囊液所制备的4个血凝单位抗原与标准阳性抗体进行血凝抑制试验（H1），效价结果分别为：10log2、10log2、10log2、10log2，阳性对照与PBS阴性对照无自凝，结果符合预期。

2.5阳性诊断抗原浓缩与灭活

含有50mL阳性病料尿囊液的18-25kDa透析袋放入10%蔗糖溶液经过6h透析，每2h换液一次，浓缩为10mL。

灭活后的阳性诊断抗原经过3代SPF鸡胚传代后，尿囊液进行RT-PCR，结果如图3。

4份阳性诊断抗原均为阴性，说明福尔马林灭活阳性尿囊液达到灭活效果。

2.6浓缩阳性诊断抗原效价测定

浓缩阳性诊断抗原通过血凝试验（HA）和血凝抑制试验（H1）检测，结果如（表4）

浓缩阳性诊断抗原血凝试验（HA）检测结果分别为210、210、210和210，符合预期；血凝抑制试验（H1）检测结果分别为10log2、10log2、10log2和10log2，符合预期。新城疫阳性诊断标准抗原血凝试验（HA）和血凝抑制试验（H1）结果分别为2。和10log2，表明浓缩阳性诊断抗原与新城疫阳性诊断抗原具有稳定良好的一致性。

3讨论

本研究通过RT-PCR从本地疑似病料中鉴别出阳性病料，利用SPF鸡胚将阳性病料纯化后进行RT-PCR检测；将纯化后的阳性尿囊液浓缩灭活制备成诊断抗原，并与鸡新城疫标准阳性诊断抗原与鸡新城疫标准阳性检测抗体进行血凝试验（HA）和血凝抑制试验（H1）的对比，检验自制诊断抗原水平是否达到预期结果。在生产实践中可以使用自制诊断抗原，快速对不同鸡群进行鸡新城疫流行病学调查和免疫抗体的检测，达到早发现、快速诊断、早治疗的目的，减少鸡场的经济损失。推广后可以对我省禽传染病的流行情况和发病情况做出更为准确的判断，为禽传染病的防治提供基础。

雞传染性法氏囊病流行特点

1法氏囊病传染性强、传播速度快，鸡群一旦发病，很快波及全群或全场；若没有继发感染，死亡率相对较低、几乎没有明显的死亡高峰现象。

2近几年无明显的季节性，一年四季均可发生。

3法氏囊病是高度直接接触性传染病，且病毒有高度的耐受性，能长期存在于鸡舍的环境中，不易清除。