乙肝病毒X结合蛋白在肝细胞癌中表达及临床意义

司 超 刘 俊 李霞斌 姚辉华

(西南医科大学临床医学院，四川 泸州 646000)

肝细胞癌(以下简称肝癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居所有恶性肿瘤的第二位。肝癌具有起病隐匿、进展迅速、恶性程度高和术后复发转移等特点，因此肝癌患者的病死率也是居高不下，占癌症相关死因的第三位〔1〕。早期诊断和治疗能够明显提高肝癌患者的临床治愈率、降低术后复发率和延长生存时间。研究表明很多分子标志物在肿瘤的早期诊断及预后评估中具有重要的价值。乙肝病毒X结合蛋白(HBXIP)是一种多功能的细胞组成型蛋白，能够与乙肝病毒DNA编码的X蛋白(HBX)的羧基末端结合，改变乙肝病毒的复制周期〔2〕。研究表明，HBXIP的表达在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和胃癌等多种恶性肿瘤中显著升高，并与肿瘤的发生发展及预后相关〔3，4〕。目前关于HBXIP与肝癌之间相关性的研究尚少见报道，本研究旨在探讨HBXIP蛋白在肝癌中表达及其与肿瘤临床病理特征之间的关系。

1 材料与方法

1.1材料 2014年12月至2017年4月西南医科大学附属医院行手术切除的肝癌存档石蜡标本54例，另选取手术切缘无肿瘤细胞浸入的肝组织标本29例作为癌旁对照与正常肝组织15例(肝囊肿14例、肝血管瘤1例)。肝癌患者年龄36～73岁，平均(48.6±9.32)岁。肝癌患者术前均未行放化疗等辅助治疗，术后病理证实为肝细胞癌。

1.2试剂和方法 HBXIP兔抗人单克隆抗体购自美国CST公司，乙二胺四乙酸(EDTA)修复液、二氨基联苯胺(DAB)显色剂购自福州迈新生物技术公司。采用免疫组化EnVision法检测HBXIP的表达，具体操作主要参照试剂盒说明书进行：对包埋石蜡块进行连续切片，脱蜡水化，3%双氧水消除过氧化物酶活性，EDTA修复液高温高压修复抗原，滴加一抗后27℃孵育60 min，滴加二抗后27℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。采用预实验中阳性片作为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.3免疫组化判定标准 以细胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒判定为HBXIP表达阳性。由两位病理医师进行双盲阅片，每张切片高倍视野(×400倍)下随机选取5个视野，根据染色强度和阳性细胞数的比例进行综合评估。染色强度：细胞无显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞数：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。然后将染色强度与阳性细胞数的评分相加，总的评分<2分为阴性，≥2分为阳性。

1.4统计分析 采用SPSS17.0统计软件包进行χ2检验。

2 结 果

2.1HBXIP在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中的表达 HBXIP的阳性表达定位于细胞质，呈弥漫性棕黄色颗粒；HBXIP在肝癌组织中的阳性表达率〔73.6%(39/54)〕明显高于癌旁组织〔48.3%(14/29)〕和正常肝组织〔33.3%(5/15)〕(P<0.05)；而在癌旁组织与正常肝组织中表达差异没有统计学意义(P>0.05)。

2.2HBXIP表达与肝癌临床病例特征的关系 肝癌组织中HBXIP表达与组织分化、癌栓形成、TNM分期相关(P<0.05)，而与肝癌患者的性别、年龄、肿瘤数目、肿瘤直径、乙肝表面抗原(HBsAg)、血清甲胎蛋白(AFP)水平、肝硬化、肿瘤转移、肝功能分级、包膜是否完整等无关(P>0.05)，见表1。

表1 HBXIP阳性表达与肝癌临床病理特征的关系〔n(%)〕

3 讨 论

肝癌的形成是一个多因素、多基因共同参与的生物学过程，而癌基因激活和抑癌基因缺失在这个过程中发挥重要的作用。HBXIP最早是由Melegari等〔2〕从肝癌HepG2细胞中筛选得到的细胞组成型蛋白，全长由173个氨基酸组成，分子量为18 kD，其编码基因位于人染色体1号染色体短臂(1p13.2)上。HBXIP是一种多功能的调节蛋白，能够与HBX蛋白和survivin蛋白相结合形成复合物，抑制caspase9的激活，从而抑制线粒体介导的细胞凋亡途径〔5〕。HBXIP可以通过激活PI3/蛋白激酶B(Akt)信号通路〔6〕，调控小鼠双微体基因(MDM)2/p53负反馈环〔7〕，调节肿瘤细胞的糖代谢〔8〕和脂代谢〔9〕等途径来促进细胞增殖。HBXIP可以激活Akt/内皮型一氧化氮合酶信号通路或上调成纤维生长因子(FGF)8、血管内皮生长因子(VEGF)的表达，促进肿瘤血管形成〔10，11〕。HBXIP还能通过激活有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MEKK)2/细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2/钙蛋白酶小亚基(Capn)4信号通路和调节组蛋白乙酰基转移酶(GCN)5介导的α-微管蛋白乙酰化，促进肿瘤细胞浸润和转移〔12，13〕。HBXIP在多种恶性肿瘤中高表达，如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌等，并与肿瘤的生长、浸润转移和预后相关。冯姝婷等〔14〕研究发现HBXIP在肝癌BEL7402、7721、HepG2、HepG3细胞中的表达较高。

本研究结果与朴俊杰等〔3〕关于HBXIP在胃癌中的研究基本一致，但李晓刚等〔4〕研究发现HBXIP在膀胱癌的细胞质和细胞核中均有表达，这种表达差异可能是HBXIP在不同肿瘤中的致癌机制存在差异或HBXIP抗体的生产厂家不同引起的。本文结果与李巍巍等〔15〕对HBXIP在子宫内膜癌中的研究相似，表明HBXIP在肝癌的发生、发展过程起重要的作用。本研究提示HBXIP的高表达可能促进了肝癌的恶性分化、浸润转移和临床进展。已有研究显示，肝癌的组织分化和癌栓形成是影响肿瘤预后的重要因素〔16〕，因此，推测HBXIP可能在肝癌的预后评估中有一定的参考价值，但是关于HBXIP在肝癌发生和发展过程中的具体作用机制仍不清楚，有待今后在分子水平上的深入研究。

综上，HBXIP在肝癌中表达上调，是肝癌发生发展过程中重要的调节因子。HBXIP表达与肝癌的浸润转移、恶性分化和临床进展相关，可能成为肝癌诊断和预后评估的分子标志物。