紫薯花色苷提取物对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化和高脂血症的作用*

韦永芳， 刘寒英， 严艳花， 朱 柳

(广州医科大学 1实验动物中心， 2中西医临床医学系， 3药学院， 广东 广州 511436)

高脂血症和高胆固醇血症是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发生和发展的重要危险因素，也是心血管疾病等发病的病理生理基础。AS是一个多因素共同参与的复杂疾病，由AS导致的心血管疾病的发病率及死亡率不断增加，已成为全球范围内人类主要死因，寻找新的预防和治疗方法势在必行。流行病学提示，黄酮类化合物在促进健康和防治心血管疾病方面具有良好的疗效。花色苷(anthocyanins，A)属于黄酮类植物化学物，广泛存在于多种食物中，包括草莓、葡萄和柑橘等浆果类水果，茄子、胡萝卜和洋葱等蔬菜，来源广泛。近年研究显示花色苷对高脂血症和AS的发生发展起到一定的抑制作用[1-3]。本研究通过高脂饮食(high-fat diet, H)诱导ApoE-/-小鼠产生AS和高脂血症，应用不同剂量的紫薯花色苷提取物进行干预，观察紫薯花色苷提取物对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化和高脂血症的作用。

材 料 和 方 法

1 实验动物

ApoE-/-小鼠购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号为SCXK(粤)2013-0002，合格证号为44007200036893。动物饲养于广州医科大学实验动物中心屏障环境的动物实验室[许可证号SYXK(粤)2016-0168]，繁育其后代用于实验。普通饲料和高脂饲料购自江苏美迪森生物医药有限公司，营养成分见表1。

表1 普通饲料和高脂饲料主要营养成分及能量构成

2 试剂和仪器

紫薯(广紫薯8号，广东省农业科学院作物研究所)花色苷提取液用浸提法提取，大孔树脂纯化制得紫薯花青素冻干粉， pH示差法测总花色苷，测得每克紫薯花青素冻干粉含总花青素为354 mg)；立普妥(lipitor, L;即阿托伐他汀钙)购自辉瑞制药有限公司(产品批号R39701)；TRIzol、TaqMan Universal PCR Master Mix、PrimeScriptTMRT-PCR Kit和SYBR Green I购自广州瑞真生物技术有限公司。DP80显微镜(Olympus)；ABI7900HT荧光定量PCR 仪(ABI)。

3 方法

3.1动物分组及处理 雄性SPF级8周龄ApoE-/-小鼠50只，体重17～19 g，饲养于广州医科大学实验动物中心，随机分成5组：对照(normal, N)组、H组、花色苷低剂量(low-dose anthocyanin, A-low)组、花色苷高剂量(high-dose anthocyanin, A-high)组和L组(n=10)。对照组给予普通饲料，其它4组均给予高脂饲料喂养8周，再别给予蒸馏水、紫薯花色苷提取物(1.67 mg·kg-1·d-1和8.35 mg·kg-1·d-1)或立普妥(2 mg·kg-1·d-1)灌胃8周，处死前禁食12 h，不禁水，取各组小鼠的血清、动脉及肝脏进行各项指标的测定。

3.2血清脂质四项检测 小鼠麻醉后心脏取血，静置离心取血清，全自动生化分析仪检测血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平,由广州市金域检验中心测定。

3.3斑块面积的测定 生理盐水灌洗干净，取出肝脏和动脉血管，一部分组织用于冰冻切片，油红O染色；另一部分置于4%的中性多聚甲醛溶液中固定后，石蜡包埋后切片，HE染色，经Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析，计算小鼠的主动脉根部粥样斑块相对面积(即斑块面积与血管腔横截面积的比值)。

3.4RT-qPCR检测主动脉炎症因子的mRNA表达水平 用TRIzol提取主动脉和肝脏组织总RNA，紫外分光光度法检测RNA的浓度，并用2%的琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性，确认无误。参照GenBank中靶基因cDNA序列设计引物(见表2)，引物由TaKaRa合成，参考PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa)说明书方法将总RNA逆转录成cDNA，反应体系由14 μL模板RNA、 2 μL enzyme mix及 5×RT 缓冲液4 μL 组成，42 ℃反应1 h，95 ℃反应5 min，即得cDNA。采用SYBR Green I荧光定量法检测主动脉中白细胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、IL-6、单核细胞趋化蛋白1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor-α, PPAR-α)和内参照β-actin的表达量。RT-qPCR 扩增体系为2× SYBR® Premix Ex TaqTMII 5 μL、上游引物(10 μmol/L)0.2 μL、下游引物(10 μmol/L)0.2 μL、cDNA 1 μL和ddH2O 3.6 μL。用ABI 7900HT 荧光定量PCR仪进行qPCR 扩增，扩增条件为: 95 ℃预变性10 min; PCR反应95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，40个循环，并添加熔解曲线。将不同浓度标准品的模板量的对数和相应的Ct值绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的拷贝数。以目的基因拷贝数与β-actin基因拷贝数比值用 2-ΔΔCt表示，计算目的基因mRNA的相对表达量。

表2 RT-qPCR引物序列

IL-1β: interleukin-1β; IL-6: interleukin-6; MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1; PPAR-α: peroxisome proliferator-activated receptor-α.

4 统计学处理

用 SPSS 18.0软件进行统计学处理。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 血脂水平

与N组相比，H组小鼠血清TC、LDL-C和HDL-C水平均显著增加(P<0.01)；与H组相比，A-low组血清TC和LDL-C水平显著降低(P<0.05), A-high组血清TG、TC和LDL-C含量均显著降低(P<0.01), L组血清TG、TC、HDL-C和LDL-C含量均显著降低(P<0.05或P<0.01)，见表3。

表3 ApoE-/-小鼠血脂水平的比较

#P<0.05,##P<0.01vsN group;*P<0.05,**P<0.01vsH group.

2 动脉粥样硬化斑块面积

油红O染色和HE染色显示，H组、A-low组、A-high组和L组均有明显AS斑块形成，可见内膜下平滑肌细胞过度增生，脂质沉积，胆固醇结晶，形成大小不等的大量泡沫细胞，内膜下有巨噬细胞浸润，形成明显的AS斑块,以H组最为明显；与H组相比，经不同剂量花色苷和立普妥灌胃治疗8周后，A-low组、A-high组和L组小鼠主动脉根部的AS斑块面积明显减小(P<0.01)，A-low、A-high组和L组之间并无显著差异，见图1、表4。

3 肝脏的病理变化

油红O染色和HE染色显示，N组肝细胞结构较清晰，细胞无脂肪变性；H组肝组织重度脂肪变性，肝细胞内可见大小不一的脂滴，呈气球样变；A-low组肝组织中度脂肪变性，以小脂滴为主；A-high组和L组肝组织轻度脂肪变性，以细小脂滴为主，见图2。

Figure 1.Atherosclerotic plaque lesion in ApoE-/- mice. A: the whole aorta stained with Oil Red O; B: cross-sectional section stained with HE (×50); C: cryostat section of aortic root stained with Oil Red O (×50).

表4 ApoE-/- 小鼠主动脉根部AS斑块的相对面积

##P<0.01vsN group;*P<0.05vsH group.

4 炎症因子的mRNA表达

RT-qPCR结果显示,高脂饮食后，H组主动脉炎症因子IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达明显增加，肝脏PPAR-α的mRNA表达明显减少；经花色苷提取物治疗后，A-low、A-high和L组主动脉炎症因子IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达明显减少，肝脏PPAR-α的mRNA表达明显增加(P<0.05)，见图3。

讨 论

以往的实验研究发现[1-3]，花色苷及其提取物可以降低心血管疾病和糖尿病等的发病风险，主要归因于其抗炎、抗氧化、调节血脂以及改善内皮功能等作用。花色苷类物质能降低血清及肝脏中脂肪含量,特别是总胆固醇、低密度脂蛋白水平，花色苷的摄入与AS的发生呈负相关。长期的流行病学调查研究发现，适度的红酒和果汁提取物等摄入可以降低AS、卒中和外周血管性疾病的发病率，这与红酒和果汁提取物中富含花色苷等多种植物化学物有关。动物实验也发现[4-5]，黑米和红米花色苷能显著降低家兔血浆TC和TG水平，延迟动脉粥样斑块形成；黑米花色苷提取物、紫薯花色苷和黑果枸杞花色苷均能显著改善ApoE-/-小鼠的血脂水平，减少斑块面积，抑制AS斑块的进一步发展[6-10]。而AS斑块的进行性增大将导致血管壁增厚、血管腔变窄，心脏供血减少，更为严重的是脆性斑块的破裂能够直接引起急性冠状动脉综合征。最近的研究发现花色苷单体矢车菊素-3-葡萄糖苷可降低血小板相关炎症因子，血浆中CCL5水平的变化与炎症因子IL-1β的变化呈正相关[11]，在体外通过抑制CCL5/CCR5介导的THP-1细胞迁移而有效抑制炎症，证明这可能是花色苷减轻炎症及抗动脉粥样硬化发展的机制之一[12]。

Figure 2. The pathological changes of the liver in the ApoE-/-mice. A: HE staining (×200); B: Oil Red O staining (×400).

Figure 3. The mRNA expression levels of IL-1β, IL-6 and MCP-1 in the aorta, and PPAR-α in the liver of ApoE-/- mice. Mean±SD. n= 3. # P<0.05, ##P<0.01 vs N group; *P<0.05, **P<0.01 vs H group.

本研究发现高脂饲喂小鼠后，H组小鼠血清的TC和LDL-C水平明显升高，由于脂质水平升高，造成肝脏严重脂肪变性，并促使大量脂质进入动脉壁，在局部沉积聚集，AS的斑块面积显著增加。紫薯花色苷提取液干预后，A-high组血清TG、TC、LDL-C和AS的斑块面积及肝脂肪变性程度都显著降低，血清中TG和TC的下降可能有助于减少斑块以及脂类物质在斑块上的继续堆积；同时LDL-C的降低能减少泡沫细胞的形成，从而抑制AS的发展。

AS是多因素共同导致的慢性复杂炎症性疾病，多种炎症介质参与AS的发生发展[13-15]。炎症的作用主要依赖于炎症细胞的浸润和促炎因子如 TNF-α、IL-1β、IL-6和hs-CRP等的产生和释放，促炎因子对AS的形成和进展密切相关[16]。趋化因子是 AS 斑块形成及不稳定的一个重要介质，它不仅能启动淋巴细胞浸润进入AS病变，还能通过增加巨噬细胞的基质降解、刺激血管平滑肌细胞和内皮细胞产生组织因子以及诱导斑块内的细胞凋亡等机制促使斑块破裂和血栓形成，进而在斑块不稳定过程中起重要作用，降低AS斑块中趋化因子的水平和给予趋化因子受体抗体可有效地减少AS发展[17-19]。本研究也证实,高脂喂养的ApoE-/-小鼠IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达水平均显著增高，紫薯花色苷提取液干预可明显降低IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达水平。紫薯花色苷提取液在一定程度上抑制AS病变的发展，这可能与降低炎症反应相关。

PPAR-α的激活可能与脂质代谢产物有关[20-21]。为防止体内过多的脂肪堆积，可以通过抑制储存在脂肪细胞中的PPAR-α酶调节，从而分解脂肪。此外PPARα激活可升高内皮细胞的MCP-1和IL-8的表达水平[22]。本研究发现高脂喂养的ApoE-/-小鼠PPAR-α表达明显降低，紫薯花色苷提取液干预提高了PPAR-α表达水平。

综上所述，本研究表明紫薯花色苷提取液能调节血脂水平，减少主动脉的斑块面积，抑制炎症反应，延缓AS 斑块进展。这为防治肝脂肪变性及动脉粥样硬化提供有效的途径。