过表达endophilin A2减轻异丙肾上腺素诱导的心肌肥大*

王昕秋悦， 湛青平， 刘 芸

(广州医科大学药学院药理学教研室, 基础医学实验教学中心机能实验室， 广东 广州 511436)

心肌肥大(myocardial hypertrophy)是心脏对持续增加的心脏负荷的一种代偿性反应，主要表现为心肌细胞体积增大、心脏重量增加、间质细胞增生以及心肌重构等[1-2]。长期的心肌肥大可使心脏进入失代偿阶段，出现心脏收缩功能和舒张功能障碍，最终导致心律失常和心衰。因此，深入研究心肌肥大的分子机制，寻找延缓或逆转心肌肥大的有效靶点，具有十分重要的意义。

吞蛋白A2(endophilin A2，EndoA2)是一类由N端Bin/amphiphysin/Rvs(BAR)结构域、中间可变的多聚脯氨酸富集序列和C端的SH3结构域组成的蛋白质，广泛表达于真核细胞中[3]。早期研究发现，EndoA2可通过其C端的SH3结构域与amphiphy-sin、 synaptojanin和dynamin等蛋白的多聚脯氨酸结构域结合，调节突触囊泡的内吞[4]。因此，早期的研究主要集中在其内吞功能，如调节表皮生长因子受体内吞和金属蛋白酶内吞等[5- 6]。近年的研究资料显示，EndoA2具有排筏的作用，可以调节其它蛋白，如ClC-3和Bax在细胞内的亚定位，从而在心血管疾病的发生发展过程中发挥重要作用。然而，EndoA2在心肌肥大中的作用国内外少有报道，值得进一步研究。本实验以SD大鼠作为主要研究对象，通过在左心室壁注射Ad-EndoA2腺病毒过表达EndoA2，探索EndoA2在异丙肾上腺素(isoprenaline，ISO)诱导的心肌肥大中的作用。

材 料 和 方 法

1 动物

健康SPF级SD大鼠28只，雄性，7～8周龄，体重(210±10) g，由广州中医药大学动物中心提供，生产许可证号为SCXK(粤)2013-0034。饲养环境模拟自然昼夜条件，温度(22±3) ℃，湿度40%～45%，自由饮水。

2 主要试剂

盐酸异丙肾上腺素(Sigma，批号15627)；Ad-EndoA2腺病毒(上海生博生物医药科技有限公司)；TRIzol Reagent(Invitrogen)；逆转录试剂盒(TaKaRa)；心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)、脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)及β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain, β-MHC)的引物序列由Invitrogen公司合成；抗LC3和 P62抗体(Cell Signaling Technology)；异氟烷(北京瑞沃德公司)；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3 主要方法

3.1动物造模与分组 将7～8周龄的健康成年SD雄鼠28只随机分为4组:假手术(sham)组、 Ad-EndoA2组、 ISO模型组和ISO+Ad-EndoA2组。Sham组采用5点注射法将磷酸缓冲盐溶液注射到大鼠心脏左心室前壁，次日背部皮下注射生理盐水； Ad-EndoA2组采用5点注射法将100 μL 1×10-6PFU/L Ad-EndoA2腺病毒注射到大鼠心脏左心室前壁，次日背部皮下注射生理盐水; ISO模型组采用5点注射法将磷酸缓冲盐溶液注射到大鼠心脏左心室前壁，次日背部皮下注射ISO(1.5 mg·kg-1·d-1); ISO+Ad-EndoA2组采用5点注射法将100 μL 1×10-6PFU/L Ad-EndoA2腺病毒注射到大鼠心脏左心室前壁，次日背部皮下注射ISO(1.5 mg·kg-1·d-1)。背部皮下注射ISO或生理盐水连续7 d。给药期间，正常饮食，自由饮水，每天记录一次大鼠的体重。7 d后取材，除ISO+Ad-EndoA2组死亡 1 只外，其余组均全部存活。

3.2超声影像学检测动物心功能 大鼠持续吸入异氟烷麻醉后，固定于37 ℃恒温加热板上，除净胸毛，于胸部涂少量耦合剂，使用VisualSonics的Vevo 2100高分辨小动物超声成像系统(RMV250探头)及15L8高频率探头Acuson Sequoia 512超声仪(Siemens)进行检测。检测时将M型取样线置于与乳头肌相切的位置，可获得相应的M型曲线。在二维超声引导下，M型超声测定大鼠左室收缩期前壁厚度(left ventricular anterior wall during systole，LVAWs)、左室收缩期后壁厚度(left ventricular posterior wall during systole，LVPWs)、左室收缩期内径(left ventri-cular ventricular internal diameter during systole，LVIDs)、射血分数(ejection fraction，EF)、短轴缩短率(fractional shortening，FS)和心输出量(cardic output，CO)。每个测定值均取5个连续完整心动周期测量取平均值。

3.3HE染色 迅速取出心脏，用4 ℃ PBS(含10% KCl)将心脏洗干净，用4%多聚甲醛固定后，可直接用显微镜拍心脏大体。固定48 h后进行石蜡包埋，随后切成4 mm厚切片，脱蜡并使用苏木精和伊红染色。在普通光学显微镜下观察心肌细胞形态。

3.4RT-qPCR 将100 mg心肌组织样本加入1 mL TRIzol试剂，置于冰上充分研磨，经异丙醇沉淀后获得心肌组织总RNA；按照逆转录试剂盒说明书方法，取500 μg总RNA在10 μL体系中逆转录合成cDNA；然后取cDNA进行扩增，以GAPDH为内参照，检测ANP、BNP及β-MHC的表达。PCR扩增条件为: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，循环40次；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。根据公式2-ΔΔCt计算ANP、BNP及β-MHC的相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

3.5Western blot实验 向洗净的心脏组织中加入裂解液研磨，4 ℃、 12 000 r/min离心15 min，离心后吸取上清，BCA法测定样品浓度。各组取样品上样，进行SDS-PAGE后将蛋白转至PVDF膜, 5%脱脂牛奶室温封闭1 h后分别敷对应 I 抗,室温孵育1 h，再4 ℃敷育过夜，次日将PVDF膜用TBST洗后，再室温敷育相应 II 抗1.5 h。化学发光ECL显影，曝光成像。以β-tubulin为内参照,利用ImageJ软件对显影的条带进行灰度分析。

4 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，各组数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 过表达EndoA2改善ISO诱导的大鼠心肌肥大过程中心功能变化

超声心动影像结果显示，与sham组相比，ISO组的LVAWs、LVPWs、FS和EF显著增加，LVIDs和CO则显著下降(P<0.05)，说明大鼠心脏明显发生了肥大，其中FS和EF显著增加，表明心脏收缩功能属于代偿性增强；过表达EndoA2则可以减轻ISO诱导的心肌肥大，改善心功能(P<0.05)，而单独过表达EndoA2对心功能无影响，见图1。

Figure 1.The representative images and analysis results of echocardiographic assessment of hearts subjected to ISO. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs ISO group.

2 过表达EndoA2降低ISO诱导的心肌肥大大鼠的心脏重量指数

ISO组大鼠的心脏重量与体重的比值(heart weight/body weight, HW/BW)及左心室重量与体重的比值(left ventricular weight/body weight, LVW/BW)较对照组显著增加(P<0.05), ISO+Ad-EndoA2组与ISO组比较则明显降低(P<0.05)，而单独过表达EndoA2对心脏重量指数无影响，见图2。

Figure 2.The analysis of heart weight/body weight ratio and left ventricle weight/body weight ratio. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs ISO group.

3 过表达EndoA2改善ISO诱导的肥大心肌组织形态学变化

为了从形态上观察肥大心肌细胞的变化情况，我们采用了HE染色的方法,结果显示，与对照组相比，ISO组大鼠心肌细胞明显增大;过表达EndoA2明显抑制ISO诱导的心肌细胞肥大，而单独过表达EndoA2对心肌细胞大小无影响，见图3。

Figure 3.The representative images and analysis results of HE staining assessment of the myocardial hypertrophy after ISO injection. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs ISO group.

4 过表达EndoA2抑制ISO诱导的胚胎基因表达

为了进一步确证EndoA2可以抑制ISO诱导的大鼠心肌肥大，我们采用RT-qPCR检测了胚胎基因的表达,结果显示过表达EndoA2可以明显抑制ISO诱导的ANP、BNP及β-MHC的mRNA表达(P<0.05)，而单独过表达EndoA2对胚胎基因的表达无影响，见图4。

5 过表达EndoA2逆转ISO引起的自噬水平降低

Figure 4.The mRNA expression of ANP, BNP and β-MHC after ISO injection. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs ISO group.

为了研究过表达EndoA2减轻ISO诱导的心肌肥大的分子机制，我们利用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3和P62的表达,结果显示与ISO处理组相比，过表达EndoA2明显加强自噬，表现为LC3-II/LC3-I比值增加，P62表达减少(P<0.05);而单独过表达EndoA2对LC3和P62的表达则无影响，见图5。

讨 论

心肌肥大是心肌细胞对急性心肌梗死、高血压和主动脉狭窄等常见临床疾病做出的适应性反应，以增加维持正常心脏功能的工作量，是一种代偿性的改变[7-8]。但这种代偿反应会增加心肌耗氧量，而冠状动脉的供血量不能满足这种耗氧量的增加，从而导致心脏由代偿性肥大过渡到失代偿性肥大，最终导致心衰。临床研究表明，心肌肥大是心血管疾

Figure 5.The representative images and analysis results of LC3 and P62 after ISO injection. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs ISO group.

病发病率和死亡率居高不下的一个独立危险因素，逆转心肌肥大可以显著改善患者的预后。因此，深入研究心肌肥大的发病机制，寻找有效的防治靶点，延缓心衰的进程，一直是心血管疾病领域长期关注的研究课题。

心肌肥大是心脏一种适应性的重塑反应，病理生理改变以心肌细胞表面积增大、蛋白合成速率增加及胚胎基因的表达增加为主要特征。心肌肥大可由多种因素诱导，其中，ISO是建立心肌肥大实验模型常用工具药之一[9-10]。本研究通过在左心室壁注射Ad-EndoA2腺病毒过表达EndoA2，然后皮下注射ISO构建大鼠心肌肥大动物模型，观察在整体动物水平EndoA2干预对心肌肥大的影响,结果表明过表达EndoA2可以减轻ISO诱导的心肌肥大，提示EndoA2可能是一个潜在的防治心肌肥大的药物作用靶点。

EndoA2最初是作为儿童白血病染色体易位的融合基因而被发现的，广泛分布在各种组织。早期关于该蛋白的研究主要集中在内吞功能，该类蛋白可通过其C端的SH3结构域与dynamin和synaptojanin等蛋白的多聚脯氨酸结构域结合，调控突触囊泡内吞。近年来的资料显示，EndoA2参与调节巨噬细胞泡沫化以及平滑肌细胞增殖与凋亡，提示EndoA2与心血管疾病密切相关[11-13]；我们的前期研究发现，EndoA2通过抑制Bax从胞浆转位线粒体，保护H2O2诱导的大鼠脑基底动脉平滑肌细胞凋亡，从而调节血管重构[11]；进一步研究发现，EndoA2促进容积调节性氯通道蛋白ClC-3从胞浆转位胞膜，从而促进氯通道开放，调节ET-1或低渗诱导的平滑肌细胞增殖[12]；此外，EndoA2通过ASK-JNK/P38信号通路增加巨噬细胞CD36和SR-A的表达，从而促进巨噬细胞泡沫化[13]。以上结果提示EndoA2对动脉粥样硬化、脑卒中等心血管疾病具有重要的调节作用。但EndoA2能否影响心肌肥大，目前尚不清楚。

在本课题中，我们在左心室壁注射Ad-EndoA2腺病毒，随后利用ISO诱导大鼠心肌肥大模型，7 d 后用小动物超声检测大鼠心脏功能。结果发现与ISO组相比，ISO+Ad-EndoA2组大鼠左室收缩期前壁厚度、左室收缩期后壁厚度、射血分数和短轴缩短率均显著下降，而左室收缩期内径以及心输出量显著增加，提示EndoA2可以减轻ISO诱导的心肌肥大，改善心功能。为了进一步确证EndoA2在心肌肥大中的作用，我们采用了测量心脏重理指数、HE染色以及RT-qPCR等方法检测心肌肥大,结果发现，与ISO组相比，ISO+Ad-EndoA2组大鼠的心脏重量指数、心肌细胞大小以及ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达显著减少，进一步提示EndoA2可以抑制ISO诱导的心肌肥大。但EndoA2调控心肌肥大的分子机制尚不清楚。有研究报道自噬在ISO诱导的心肌肥大中发挥重要作用[10]，笔者前期研究证实EndoA2通过加强自噬保护H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡[14]，那么EndoA2是否通过调节自噬调控心肌肥大的呢？ LC3蛋白是自噬体形成的标志蛋白。在自噬被诱导后，位于胞浆中的LC3-I与磷脂酰乙醇胺结合，形成锚定在自噬体膜上的LC3-II，标志自噬体形成。P62通过直接与膜上的LC3-II结合，特异性地融合到自噬中而被降解。因此，P62的表达水平与自噬活性成反比。本研究的Western blot结果显示，ISO诱导心肌肥大后，LC3-II/LC3-I比值下降，P62表达增加，自噬被抑制;过表达EndoA2明显逆转ISO引起的自噬水平降低。这表明EndoA2可能通过加强自噬减轻ISO诱导的心肌肥大。

综上所述，我们发现过表达EndoA2可以减轻ISO诱导的心肌肥大，该作用可能与EndoA2加强自噬有关。今后的工作中，我们将进一步在体外明确EndoA2调控心肌肥大的作用及具体分子机制，为明确EndoA2是否可以作为心肌肥大治疗的新靶点提供初步的实验依据。