低能量LED蓝光对人根尖乳头干细胞体外增殖的影响

2018-12-26杨瑶瑶朱婷婷

西南医科大学学报 2018年6期

杨瑶瑶，朱婷婷，王瑶

（1西南医科大学附属口腔医院口腔预防保健科，四川泸州 646000；2烟台市口腔医院儿童牙科）

2006年Sonoyama W从人年轻恒牙根尖乳头中成功分离出根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla，SCAPs)，有研究发现SCAPs具有自我更新及形成牙本质、成骨等多向分化能力[1]。低能量LED蓝光照射生物组织，可调节细胞功能[2]，提高不同类型细胞的增殖和分化能力[3]，如乳牙牙髓干细胞[4]、骨髓间充质干细胞及心肌干细胞[5]、人皮肤细胞[6]等。LED蓝光是一种安全、有效的窄谱光源，对正常组织细胞几乎无毒性，其促进细胞分化抑制细胞增殖的作用要强于红光[7]。但既往研究主要集中在红光和激光，对LED蓝光的涉入较少，在牙源性干细胞方面的研究更少。目前，LED蓝光对SCAPs增殖的影响尚不明确，评估LED蓝光对SCAPs增殖的影响，为实验研究和临床治疗方法提供参考具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

胎牛血清（四季青，中国）；DMEM/LOW（Hy-Clone，美国）；I型胶原酶（Biosharp，美国）；Dispase酶（Yeasen，美国）；小鼠抗人CD146、小鼠抗人CD45（Ebioscience，美国）；小鼠抗人 CD90、小鼠抗人CD105（三箭生物，中国）；MTT粉剂（Biosharp，美国）；流式细胞仪（Biorad，美国）；LED蓝光（桂林市啄木鸟，中国）；能量测光表（桂林市啄木鸟，中国）；全光谱分光光度计（SBK-YLQX，美国）。

1.2 SCAPs的分离、培养、鉴定

细胞组织取自根尖未闭合的年轻恒牙，主要来源于本地口腔医院因正畸治疗需要拔除的前磨牙或阻生牙。患者健康无全身性疾病，牙体完整无病变，根尖未闭合无炎症。将根尖乳头组织清洗、剪碎、离心，加入1 mL I型胶原酶（3 mg/mL）和1 mL Dispase酶（4 mg/mL），370C孵育15～30 min，吹打呈絮状，终止消化，离心后接种培养。镜下见组织块周围细胞爬出，每3 d换液。单克隆纯化原代SCAPs，消化扩大培养。取生长状态旺盛的第2代SCAPs，流式细胞仪检测SCAPs表面抗原CD90、CD146、CD105、CD45。

1.3 MTT法检测低能量LED蓝光干预下SCAPs的增殖情况

低能量LED蓝光420～470 nm，光源距细胞层面1 cm，光功率密度100 mW/cm2。实验分为成骨诱导（ODM）组与普通培养基（DMEM）组，每组又分为非光照组A及光照组B～E，光照组分别以1、2、3和4 J/cm2为照射剂量，暗房内同一个人定时定点隔天光照。光照能量密度计算公式：能量密度=能量功率×时间。

取对数生长期第3代SCAPs，以4×103/孔接种于96孔板，设5个复孔，次日随机分组并进行光照，ODM组更换成骨诱导液，DMEM组更换普通培养液，每3 d换液。光照时细胞均移出孵箱，置于暗房内，根据不同光照强度进行光照。MTT检测第1、3、5、7和9 d的各组OD值。移除孔内原培养基，各孔分别注入200 μL低糖DMEM，避光下各孔再注入20 μL 5 mg/mL MTT液，避光孵育4 h。去尽孔内培养液，加入150 μL/孔二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。摇床上震摇10～20 min，全光谱分光光度计490 nm波长下检测各孔的吸光值（OD），根据时间和OD值，绘制SCAPs的生长曲线图。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示，采用Type III Tests of Fixed Effectsa统计分析数据，P＜0.05表明各组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人根尖乳头干细胞(SCAPs)的分离培养、纯化及鉴定

年轻恒牙根尖牙乳头组织呈淡粉红色，质软，易与牙髓组织分离（图1）；原代培养5 d后镜下见细胞从组织块边缘长出，细胞形态多为长梭形，形成生长晕（图2）；流式细胞仪鉴定第2代SCAPs表面抗原测定结果为：CD105阳性率98.31%、CD146阳性率45.20%、CD90阳性率99.90%和CD45阴性率0.02%（图3）。

图1 人根尖牙乳头组织

图2 第5 d细胞从贴壁组织块长出(×40)

图3 流式细胞仪鉴定第2代SCAPs表面抗原测定结果

2.2 低能量LED蓝光干预下SCAPs增殖情况

根据MTT检测数据绘制SCAPs的生长曲线(图4)。可见各实验组SCAPs第1～3 d为缓慢增殖期、第3～7 d为快速增殖期、第7～9 d为稳定期，各组总增殖趋势近似“S”形曲线。每个组SCAPs增殖情况结果见表1、2。相同培养基中，ODM组中第3、5、7和9 d各时间点光照组增殖速率低于非光照组，其中2、3和4 J/cm2与0 J/cm2具备统计学意义（P ＜ 0.05），第3、5 d各光照能量梯度之间增殖速率也存在一定差异。DMEM组中1、2、3、4 J/cm2增殖速率高于0J/cm2，但并无完全具有统计学意义，第5、7、9 d光照组4 J/cm2增殖速率高于非光照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。如图5示相同光照强度下，DMEM组SCAPs增殖速率均高于ODM组，第3、5、7和9 d光照组2、4 J/cm2差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）。

图4 低能量LED蓝光干预下SCAPs生长曲线

表1 低能量LED蓝光对SCAPs ODM组增殖能力的影响（OD490值）

注：a与非光照组对比，P＜0.05；实验亚组两两比较：b与1 J/cm2光照能量比较，P＜0.05；c与2 J/cm2光照能量比较，P＜0.05；d与3 J/cm2光照能量比较，P ＜ 0.05

光能量密度（J/cm2）照射天数0 1 2 3 4第1 d 0.448±0.054 0.537±0.017a 0.480±0.022b 0.340±0.062abc 0.476±0.025bd第3 d 0.750±0.014 0.727±0.012a 0.710±0.031a 0.608±0.029abc 0.612±0.029abc第5 d 1.414±0.068 1.280±0.046a 0.967±0.049ab 1.136±0.090abc 1.110±0.105abc第7 d 1.744±0.054 1.635±0.118 1.553±0.096a 1.584±0.076a 1.561±0.094a第9 d 1.696±0.116 1.515±0.093a 1.495±0.092a 1.423±0.113a 1.514±0.104ad

表2 低能量LED蓝光对SCAPs DMEM组增殖能力的影响（OD490值，）

注：a与非光照组对比，P＜0.05；实验亚组两两比较：b与1 J/cm2光照能量比较，P＜0.05；c与2 J/cm2光照能量比较，P＜0.05；d与3 J/cm2光照能量比较，P ＜ 0.05

光能量密度（J/cm2）照射天数0 1 2 3 4第1 d 0.645±0.027 0.621±0.026a 0.565±0.077ab 0.648±0.008 0.697±0.042abc第3 d 0.792±0.016 0.740±0.038a 0.765±0.049 0.663±0.088ac 0.815±0.042bd第5 d 1.453±0.033 1.514±0.122 1.498±0.065 1.500±0.127 1.617±0.082ac第7 d 1.750±0.078 1.793±0.094 1.938±0.096a 1.718±0.154c 2.158±0.172abcd第9 d 1.661±0.098 1.659±0.082 1.796±0.109a 1.708±0.066 2.147±0.136abcd

图5 ODM组与DMEM组SCAPs的增殖变化

3 讨论

研究表示SCAPs来源于早期成牙本质细胞且对根部牙本质的形成、牙根发育有重要作用[1,8]。SCAPs具有较高增殖、分化、促进根尖周组织愈合能力[9]，在骨及牙组织再生方面有重要意义，有望治疗多种原因引起的年轻恒牙病变。光生物调节法（photobiomodulation，PBM）是利用低能量LED蓝光照射生物组织，对其细胞功能进行调制的一种方法。在临床上可通过选用正确的参数和适应症，PBM作为辅助治疗，改善临床疗效[10]。LED蓝光具有广谱的抗菌作用[11]，能杀灭革兰阳性和革兰阴性菌。波长450～475 nm的LED蓝光，临床上被首选治疗新生儿黄疸[12]。可见蓝光可促进人角质细胞和内皮细胞分化标记物的增加[6]。Higuchi实验中发现1 mW/cm2波长470 nm蓝光可影响羊水间充质干细胞的增殖和成骨分化[7]。光剂量范围从0.5～10 J/cm2之间被认为可诱导细胞增殖[13]。光能量密度在0.5～4 J/cm2之间，刺激干细胞生长方面更有效[14-17]。所以本实验采用420～470 nm，功率1 mW/cm2，光能量密度0～4 J/cm2的低能量LED蓝光，研究LED蓝光对SCAPs增殖的影响。

本实验获取的原代SCAPs呈长梭形、贴壁生长，能够形成细胞克隆集落，并具有自我更新能力。SCAPs间充质干细胞表面抗原CD105、CD146、CD90阳性表达和造血细胞表面标记物CD45阴性表达，与以往根尖乳头细胞提取中获得的结果相同，表明SCAPs来自骨髓间充质干细胞，具有间充质干细胞特性[18-19]。MTT结果显示整体分组趋势倾向于“S”形曲线，说明获取的SCAPs处于对数期，细胞活性好，具有良好的生长能力[20]。相同光能量密度下，DMEM组的增殖率高于ODM组，其原因可能是ODM组中成骨诱导液促进了SCAPs的分化，抑制了增殖。与Owen TA[21]研究中矿化液抑制细胞增殖，促进成骨表达这一点一致。相同培养基中，光照组与非光照组间有差异。ODM组中非光照组增殖率高于光照组，随着时间推移，光照组增殖率明显低于0 J/cm2，表明在矿化条件下LED蓝光可抑制SCAPs的增殖，时间越长，抑制效果越明显。初步证实LED蓝光与矿化培养基存在协同作用，有利于SCAPs的分化，这与Robertson[6]的报道结果相似。而DMEM组中光照组增殖速率高于非光照组，增值率最高为4 J/cm2，同样随时间增长，差异越明显，说明LED光作为辅助工具，在普通培养基中可以通过光照促进细胞的增殖。以往实验研究中虽然有4 J/cm光照能量的报道[22]，但是整体的光能量参数仍然参差不齐。本实验利用有效光能量参数0～4 J/cm2，得出在ODM组和DMEM组中，相比非光照组，光照组1～4 J/cm2的增殖率都有所改变，其中4 J/cm2改变较明显，表明在普通培养基和矿化条件下4 J/cm2低能量LED蓝光对SCAPs生物特性影响较大，可以更好的促进细胞的增殖分化。因此，在一定条件下可通过LED蓝光影响SCAPs增殖特性，有利于SCAPs在组织工程中的发展。虽然有学者指出ATP/cAMP通路可能是调节光照射引导细胞增殖的机制，所以光照可以调节细胞的平衡参数，如氧化还原的敏感因子的表达等导致细胞的增殖发生变化[23]。但是机制尚不完全统一，目前LED蓝光对SCAPs的机制有待进一步研究。