保肝汤对小鼠四氯化碳致慢性化学性肝损伤的保护作用*
2018-12-26李谚语张英利
李谚语,刘 丽,范 颖,李 军,张英利,卢 健
(辽宁中医药大学,沈阳 110847)
肝脏是人体主要的代谢器官,肝损伤常见的原因有病毒感染、创伤、及化学中毒等[1]。据统计,全世界每年10万人中约有13.9~24.0人发生药物性肝损[2]。因此寻求抗肝损伤,抗肝纤维化的药物日益受到关注。保肝汤由黄芪、葛根、枸杞子、五味子等组成,具有疏肝理气、清热解毒的功效。本研究旨在分析中药保肝汤对四氯化碳(CCl4)致慢性化学性肝损伤小鼠的肝脏保护作用。
1 材料
1.1 实验动物 SPF级昆明种小鼠84只,雄性,体质量20~25 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号SCXK(京)2012-0001。
1.2 实验药物 保肝汤:由黄芪、葛根、枸杞子、五味子等组成(饮片购自辽宁中医药大学附属医院)。用10倍蒸馏水浸泡上述饮片30min,煎煮1h,过滤,取滤液;再加8倍蒸馏水于药渣,煎煮40 min,过滤,取滤液;合并两次煎煮滤液,浓缩,分别配置高、中、低剂量灌胃药液,备用。其中高、中、低剂量组灌胃药液浓度分别为含生药 0.024 g/mL、0.012 g/mL、0.006 g/mL。护肝片:由柴胡、茵陈蒿、板蓝根、绿豆、五味子、猪胆粉组成(批号:201405080,购自黑龙江葵花药业股份有限公司)。将护肝片配制成浓度为含生药0.006 g/mL的溶液,备用。
1.3 主要试剂 丙氨酸转氨酶(ALT)测试盒(1113051,南京建成生物工程研究所);天冬氨酸转氨酶(AST)测试盒(CH0105202,南京建成生物工程研究所);丙二醛(MDA)测试盒(20140530,南京建成生物工程研究所);超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(20140529,南京建成生物工程研究所);BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号:201404,北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);甘油三酯(TG)测试盒(批号:1213061,南京建成生物工程研究所)。
1.4 主要仪器与设备 电子天平(ALC-210.3,赛多利斯科学仪器);台式高速大容量冷冻离心机(TGL20M-Ⅱ,湖南省凯达实业以展);台式高速冷冻离心机(Neofuge 13R,上海力申科学仪器);全自动生化仪(TBA-40FR,日本东芝);-80℃冰箱(DWHL38,中科美菱);电热恒温培养箱(SHA-C,常州国华电器)。
2 实验方法
2.1 分组方法 将84只昆明小鼠随机分为6组,即正常组、模型组、护肝片组、保肝汤高剂量组、保肝汤中剂量组、保肝汤低剂量组,每组14只。
2.2 造模与给药方法 适应性喂养1周后,除正常组外,其余各组分别在实验第 1、3、10、16、22、25、28天腹腔注射0.5%CCl4;于造模后第10天开始灌胃,其中正常组和模型组给予蒸馏水(0.01 mL/g)灌胃,护肝片(0.5 g/kg)及保肝汤高剂量组(32 g/kg)、保肝汤中剂量组(16 g/kg)、保肝汤低剂量组(8 g/kg)分别给予灌胃药液。第30天灌胃2 h后称质量,腹主动脉取血,于肝左、右中叶、尾状叶各取材1块,置于4%多聚甲醛溶液中固定,待测病理;将取材后的肝脏以冷生理盐水冲洗后,置低温冰箱保存,待测指标。
2.3 病理组织学检测及肝脏指数计算 病理组织学检测:取4%多聚甲醛溶液中固定的肝组织用石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察。
计算肝指数:肝脏指数=肝脏质量/进食体质量[3]。
2.4 指标测定 采用基于IFCC2002配方法检测血清ALT、AST的活性;采用抽提法测定SOD,采用TBA法测定MDA含量;严格按试剂盒操作。
2.5 数据处理 采用SPSS 19.0统计软件进行分析,实验数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法,P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 对肝组织病理的影响 在光学显微镜下观察,模型组中央静脉和肝细胞形态、结构变形明显,肝细胞肿胀,细胞核变大,肝细胞界限不清,有的部位核仁消失,可见多处大片肝细胞脂肪变性,并见多处灶状坏死。表明实验造模成功。保肝汤各剂量组与模型组比较在肝组织形态及结构上均有所改善,中、低剂量组肝组织镜下改变明显肝组织形态结构接近正常,散见肝细胞脂肪变性。见图1。
3.2 对肝指数的影响 与正常组相比,模型组及保肝汤高、中、低剂量组肝指数升高明显(P<0.05);与模型组比较,保肝汤无统计学差异(P>0.05)。见表1。
3.3 保肝汤对实验小鼠血清ALT、AST、AST/ALT的影响
3.3.1 对ALT的影响 与正常组比较,模型组ALT明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,保肝汤高、中、低剂量组ALT均明显降低(P<0.05)。保肝汤中剂量组比低剂量组明显降低(P<0.05)。见表 2。
3.3.2 对AST的影响 与正常组比较,模型组AST显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,保肝汤中剂量组AST明显降低(P<0.05);保肝汤中剂量组AST值低于保肝汤低剂量组(P<0.05)。见表2。
图1 保肝汤对小鼠肝组织形态的影响(肝组织HE,×400)Fig.1 Effect of Baogan Decoction on the morphology of liver tissueof mice(HE,×400 of liver tissue)
表1 对肝指数的影响(s)Tab.1 Influenceon liver index(±s)
表1 对肝指数的影响(s)Tab.1 Influenceon liver index(±s)
注:与正常组比较,*P<0.05。
组别 动物数 肝指数(%)正常组 14 4.10±0.33模型组 12 4.56±0.48*护肝片 13 4.50±0.66保肝汤高剂量组 13 4.68±0.52保肝汤中剂量组 12 4.74±0.46保肝汤低剂量组 13 4.49±0.59
3.3.3 对AST/ALT的影响 与模型组比较,保肝汤高、中、低剂量组均显著升高(P<0.05)。见表2。
3.4 保肝汤对实验小鼠血清SOD、MDA、TG的影响
3.4.1 对SOD的影响 与模型组比较,保肝汤高、中、低剂量组SOD值均有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05)。保肝汤中剂量组与正常组比较显著升高(P<0.05)。见表 3。
表 2 对 ALT、AST、AST/ALT 的影响(±s)Tab.2 Influenceon ALT、AST、AST/ALT(±s)
表 2 对 ALT、AST、AST/ALT 的影响(±s)Tab.2 Influenceon ALT、AST、AST/ALT(±s)
注:与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与中剂量组比较,#P<0.05。
组别 动物数 ALT(U/L) AST(U/L) AST/ALT正常组 14 42.08±7.66 81.69±12.78 1.98±0.35模型组 12 54.23±12.57* 125.77±30.04* 2.52±1.35护肝片 13 37.40±6.70 100.40±21.33 2.72±0.57Δ保肝汤高剂量组 13 36.71±13.32△ 110.64±28.22 3.37±1.76△保肝汤中剂量组 12 34.71±6.26△ 97.50±21.63△ 2.87±0.66△保肝汤低剂量组 13 43.00±17.89△# 120.73±33.56# 3.01±0.85△
3.4.2 对MDA的影响 与正常组比较,模型组MAD值明显升高(P<0.05)。与模型组比较,保肝汤中剂量组和低剂量组显著降低(P<0.05)。保肝汤高剂量组和中剂量组比较显著升高(P<0.05)。见表3。
3.4.3 对TG的影响 与模型组比较,保肝汤高剂量组和低剂量组显著升高(P<0.05)。保肝汤低剂量组TG值明显高于保肝汤中剂量组(P<0.05)。见表3。
表 3 对 SOD、MDA、TG 的影响(±s)Tab.3 Influence on SOD、MDA、TG(±s)
表 3 对 SOD、MDA、TG 的影响(±s)Tab.3 Influence on SOD、MDA、TG(±s)
注:与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与保肝汤中剂量组比较,#P<0.05。
组别 动物数 SOD(U/mg) MDA(nmol/mL) TG(mmol/L)正常组 14 258.86±91.45 0.42±0.06 1.39±0.40模型组 12 272.88±25.49 0.57±0.03* 1.09±0.31护肝片 13 261.56±43.56 0.51±0.08 1.22±0.42保肝汤高剂量组 13 272.96±51.33 0.55±0.06# 1.59±0.39Δ保肝汤中剂量组 12 307.97±44.42 0.44±0.09Δ 1.30±0.30保肝汤低剂量组 13 290.25±38.67 0.48±0.07Δ 1.67±0.49△#
4 讨论
CCl4是化学性肝毒剂,腹腔注射能引起实验动物膜通透性增加,细胞内的酶释放,其分子中的三氯甲基基团经催化后形成三氯甲基过氧化基团,引起了肝细胞脂质过氧化反应,进而导致肝脏损伤及肝功能异常[4-5]。本实验通过复制CCl4致慢性化学性肝损伤模型,研究保肝汤对CCl4致慢性化学性肝损伤的保护作用。
ALT和AST是反映肝损伤程度的指标[6],其中ALT是最常用的判断肝细胞是否受损的敏感指标;AST大幅度升高意味着肝细胞损伤的程度比较严重[7]。AST/ALT比值增大,说明肝细胞损伤程度严重且认为是慢性化程度加重的标志[8]。本研究中,保肝汤高、中、低剂量组ALT水平较模型组明显降低。保肝汤高、中、低剂量组AST水平均较模型组降低,其中保肝汤中剂量组最低。保肝汤高、中、低剂量组AST/ALT值较模型组均升高。结果表明保肝汤对小鼠肝损伤有一定保护作用;保肝汤中剂量降低肝细胞的损伤程度在保肝汤3组中效果最好;在肝损伤慢性化程度进展上保肝汤各剂量组均无明显作用。
SOD是一种抗氧化酶,SOD的活性可以反映自由基的清除率。MDA是脂质过氧化的主要产物,间接反应肝损伤程度[9-11]。TG在肝脏、脂肪等组织中进行合成,肝脏也将血液中的糖类转化为TG。本研究中,模型组SOD稍升高,和空白组比较无统计学差异,这与其他实验研究趋势不同[12-13],考虑是CCl4进入机体后激活了机体的氧化应激信号通路,引起SOD应激性升高。实验结果显示,保肝汤中剂量组SOD明显升高,MDA值最低,可见,保肝汤中剂量组的脂质过氧化产物最少,脂质过氧化程度最轻,对清除自由基、抑制自由基启动脂质过氧化反应效果最好。此外,保肝汤高剂量组和低剂量组与模型组比较TG值显著升高,说明保肝汤高、低剂量组对肝脏的作用倾向于提高肝脏对TG的合成。
由此可见,保肝汤能够减轻CCl4对小鼠肝细胞的损伤程度,并具有一定的保肝作用,其中,以保肝汤中剂量组作用最优;作用机制与抑制肝损伤后脂质过氧化反应有关。