N—乙酰半胱氨酸对烟雾吸入大鼠急性肺损伤的疗效观察

2018-12-25王文迪李小兵刘光晶

医学信息 2018年23期

王文迪李小兵刘光晶

摘要：目的观察N-乙酰半胱氨酸对烟雾吸入所致大鼠急性肺损伤的治疗效果。方法将健康雄性大鼠108只随机分为空白对照组、损伤对照组、NAC低、中、高剂量组、阳性对照组，每组各18只。除空白对照组外其余各组均制作烟雾吸入性急性肺损伤模型。NAC低、中、高剂量组分别于伤后2 h给予大鼠腹腔注射NAC 100、200、300 mg/kg，阳性对照组于伤后2 h给予大鼠腹腔注射地塞米松10 mg/kg，损伤对照组模型成功后不予处理。比较6组大鼠血气分析情况，采用免疫组化法检测大鼠肺组织NF-kB（p56）及IkB-α的活性，放射免疫分析法测定大鼠肺组织匀浆中TNF-α及IL-6的含量，计算大鼠肺系数和肺湿干重比。光镜下观察大鼠肺组织病理改变、透射电子显微镜观察肺组织亚细胞结构改变。结果血气分析结果显示，NAC低、中、高剂量组及阳性对照组与损伤对照组比较，各指标差异均有统计学意义（P<0.05），其中PaO2，SaO2及BE值均上升，PaCO2，HCO3-下降（P<0.05）；NAC低、中、高剂量组和阳性对照组与损伤对照组比较，肺组织TNF-α及IL-6的含量下降，差异有统计学意义（P<0.05）；NAC低、中、高剂量组、阳性对照组与损伤对照组比较，PWI和W/D均下降，差异有统计学意义（P<0.05）；NAC低、中、高剂量组、阳性对照组与损伤对照组相比，NF-kB（p56）在细胞核及胞浆中的阳性反应减弱，差异有统计学意义（P<0.05）；损伤对照组与空白对照组相比，IkB-α呈强阳性免疫反应，阳性免疫反应产物分布在阳性细胞的胞浆中，差异有统计学意义（P<0.05）。NAC低、中、高剂量组、阳性对照组与损伤对照组相比，IkB-α在胞浆中的阳性反应减弱，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 N-乙酰半胱氨酸对大鼠烟雾吸入所致急性肺损有保护作用，能够减轻大鼠肺水肿及炎症反应。

关键词：吸入性损伤；乙酰半胱氨酸；肺；肿瘤坏死因子；炎癥反应；地塞米松

中图分类号：R563 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.23.027

文章编号：1006-1959（2018）23-0101-04

Abstract：Objective To investigate the therapeutic effects of N-Acetylcysteineon smoke inhalation-induced acute lung injury in rats.Methods 108 healthy male rats were randomly divided into control group， injury control group， low， middle and high NAC groups， and positive control group （18 rats in each group）.The model of acute lung injury induced by smoke inhalation was made in all groups except the blank control group.The rats in the low， middle and highNAC groups were given intraperitoneal injection of NAC 50，100，150 mg/kg 2 h after injury. The rats in the control group were given 10 mg/kg of dexamethasone 2 h after injury.The model of injury control group was not treated after successful construction.Comparison of blood gas analysis in 6 groups of rats was made，the activities of NF-kB（p56） and IkB-α in rat lung tissue were detected by immunohistochemical method.The contents of TNF-α and IL-6 in the lung homogenate of rats were measured by radioimmunoassay， and the lung coefficient and lung wet dry weight ratio were calculated.Then the pathological changes of lung tissue were observed under light microscope and the changes of subcellular structure in lung tissue were observed by transmission electron microscope （TEM）.Results The results of blood gas analysis showed that there were significant differences between the low， middle and high doses of NAC and the positive control group compared with the injured control group （P<0.05）.PaO2，SaO2 and BE both increased and PaCO2，HCO3- decreased （P<0.05）.The contents of TNF-α and IL-6 in lung tissue decreased in low， medium and high dose of NAC and positive control group （dexamethasone） compared with the injured control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Compared with the injured control group， PWI and W/D decreased significantly in the low， middle and high dose groups of NAC and the positive control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Compared with the injured control group， the positive reaction of NF-kB（p56） in the nucleus and cytoplasm was decreased in the low， medium and high dose groups of NAC， and the positive reaction in the positive control group was lower than that in the injured control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Compared with the control group， IkB-α showed strong positive immunoreactivity， and the positive immunoreactive products were distributed in the cytoplasm of the positive cells，the difference was statistically significant（P<0.05）.The positive reaction of IkB-α in cytoplasm of the low， middle and high dose groups of NAC and the positive control group was significantly lower than that of the injured control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion N- acetylcysteine has protective effect on acute lung injury induced by smoke inhalation in rats and can alleviate pulmonary edema and inflammation in rats.

Key words：Inhalation injury；Acetylcysteine；Lung；Tumor necrosis factor；Inflammatory reaction；Dexamethasone

烟雾吸入性损伤常发生于不通风或密闭的环境中，包括热力损伤和烟雾损伤，热力损伤主要是吸入大量干热和湿热的空气导致呼吸道、肺实质损伤，烟雾损伤主要是吸入大量炭粒和化学物质，导致呼吸道、肺实质化学性损伤，烟雾吸人性损伤的发病率和病死率都很高[1]。大面积烧伤合并吸入性损伤是指患者发生严重烧伤的同时，因吸入有毒烟雾或烧伤性化学物质而导致呼吸道受到化学性损伤，情况严重者甚至损伤肺实质。烧伤合并吸入性损伤约占烧伤患者总数的5%～10%，重度吸入性损伤的病死率可高达80%，是烧伤三大致死原因之一[2]。目前临床对烟雾吸入所致急性肺损伤治疗有针对性的药物不多，主要以清除分泌物和气道盥洗等机械性治疗为主[3]。N-乙酰半胱氨酸是一种痰液裂解剂，对多种呼吸道疾病如慢性阻塞性肺疾病、肺间质纤维化、急性肺部感染有一定疗效[4]，但对吸入性损伤的治疗效果罕见报道，本实验对N-乙酰半胱氨酸治疗吸入性损伤大鼠的治疗效果进行研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料實验动物选自天津市第一中心医院动物实验中心提供的清洁级健康雄性Wistar大鼠SPF级108只，体重200～250 g，平均体重（220.30±11.00）g，喂养于光照12 h、相对湿度40%～60%、温度23～25 ℃、自由进食水的环境中。仪器包括BP-6动物无创血压检测仪、BL420生物机能实验设备、医用离心机、Olympus光学显微镜、TP-100型电子天平、CG-1200γ放射免疫计数器、微量移液器。

1.2方法

1.2.1模型建立及实验分组将SPF级健康雄性Wistar大鼠随机分成6组，每组18只，分别为空白对照组、损伤对照组、NAC低、中、高剂量组、阳性对照组。空白对照组常规饲养不作处理，余5组以腹腔注射水合氯醛300 mg/kg麻醉后，参照文献[5]制作烟雾吸入性急性肺损伤模型。其中损伤对照组模型制作成功后不作处理，NAC低、中、高剂量组分别于造模后2 h腹腔推注NAC 100、200、300 mg/kg。阳性对照组于造模后2 h腹腔推注地塞米松10 mg/kg。伤后4 h给予20%乌拉坦10 ml/kg腹腔麻醉，肝素抗凝。开胸于左心室采血测动脉血气，肉眼观察肺组织被膜、肿大及淤血程度等病理改变；摘取右肺组织洗干表面水分，称取100 mg右肺组织置于匀浆器，加入3倍体积磷酸盐缓冲液，冰浴匀浆，离心后取上清液使用放免试剂盒检测TNF-α及IL-6的含量。右肺剩余组织测定肺系数（PWI=肺重/体重×100%）和肺湿/干重比（W/D）；取左肺组织用免疫组化法检测NF-kB（p56）及IkB-α的活性。

1.2.2免疫组化染色及结果判定阳性细胞百分比按视野内阳性细胞所占总细胞数≤25%，26%～50%，51%～75%，≥75%分别计为0，1，2，3，4分。按阳性细胞着色无、弱（淡黄）、中（棕黄）、强（棕褐）分别计为0，1，2，3分。结果判定标准：以上2种计分结果相加，0分为-，2～3分为+，4～5分为++，6～7分为+++。每张切片随机随机取5个400倍视野，每个视野均进行阳性细胞百分比计分与着色强度计分，5个视野计分的平均值为改切片的最后得分。

1.2.3 HE染色常规脱水、包埋、切片、染色，染色过程中将HE充分利用起来，400倍光学显微镜下对大鼠分组织进行病理形态学观察。

1.3统计学方法应用SPSS 17.0统计软件处理数据，计量资料采用（x±s）表示，行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6组大鼠血气分析比较 NAC低、中、高剂量组及阳性对照组与损伤对照组各指标比较，其中PaO2，SaO2及BE值均上升（P<0.05），PaCO2，HCO3-均下降（P<0.05），见表1。

2.2肺组织TNF-α及IL-6含量比较损伤对照组与空白对照组比较，肺组织TNF-α及IL-6含量上升（P<0.05）；NAC低、中、高剂量组和阳性对照组与损伤对照组比较，肺组织TNF-α及IL-6含量下降，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3肺系数和肺湿/干重比变化比较 NAC低、中、高剂量组、阳性对照组与损伤对照组比较，PWI和W/D均下降，差异有统计学意义（P<0.05）；NAC低剂量组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

2.4肺组织NF-kB（p56）及IkB-α活性比较 NF-kB（p56）呈强阳性免疫反应，阳性免疫反应产物不仅分布在阳性细胞的胞浆中，细胞核中阳性蛋白表达也呈强阳性，可见明显的细胞核移位，表面NF-kB（p56）已活化，按判定标准计分原则比较，差异有统计学意义（P<0.05）。NAC低、中、高剂量组、阳性对照组与损伤对照组相比，NF-kB（p56）在细胞核及胞浆中的阳性反应减弱，差异有统计学意义（P<0.05）。损伤对照组与空白对照组相比，IkB-α呈强阳性免疫反应，阳性免疫反应产物分布在阳性细胞的胞浆中，差异有统计学意义（P<0.05）。NAC低、中、高剂量组、阳性对照组与损伤对照组相比，IkB-α在胞浆中的阳性反应减弱，差异有统计学意义（P<0.05），见表4。

2.5肺组织病理学检查空白对照组肺组织表面及镜下病理学未见异常，见图1。损伤对照组肺组织膨大、淤血，肺组织表面可见大小不等的暗红色斑点状病灶，被摸光亮、湿润。镜下肺泡壁破坏严重，肺泡隔增厚，肺间质及肺泡腔严重水肿、渗出及出血，大量粒细胞浸润及透明膜形成，见图2。而应用NAC治疗的各组肺组织相对损伤对照组随计量增加体积膨大程度、淤血、暗红色程度依次减轻，NAC高剂量组可见光镜下肺泡壁多数完整，肺泡隔较阳性对照组明显变窄。腔内少许出血、渗出及细胞浸润，见图3。

3 讨论

吸入性损伤患者预后与其伴发的肺部严重炎症反应密切相关。吸入性损伤发生时，由于缺血、物理化学刺激等因素，大量中性粒细胞聚集于肺部，并伴随抗氧化酶的大量消耗。中性粒細胞可分泌TNF-α及IL-6等多种炎症因子。炎症因子的聚集和激活是引起肺部毛细血管和肺泡损伤的主要原因之一，往往诱发广泛而剧烈的肺局部组织炎症反应和急性呼吸功能障碍。NF-kB是细胞中的一种快反应转录因子，细胞在静息状态时，NF-kB（p56）与其抑制蛋白结合，以无活性的状态存在于细胞质内，当细胞损伤受刺激后，NF-kB（p56）再从细胞质转移到细胞核内，与NF-kB（p56）形成二聚体，它的激活转录可导致肺泡上皮细胞及肺泡巨噬细胞等释放大量促炎性细胞因子，介导肺泡上皮细胞产生炎症反应[6]。本研究显示大鼠经烟雾吸入致急性肺损伤后，PaO2，SaO2及BE值均显著下降；PaCO2，HCO3-均上升，组织进入强烈的缺氧状态。同时肺组织TNF-α及IL-6的含量显著上升，NF-kB（p56）和IkB-α免疫组化呈强阳性表达，与相关报道一致[7]。

NAC是左旋精氨酸的天然衍生物，分子内含有活性的SH基团，能将痰液中黏蛋白的二硫键（SS）裂断，使黏蛋白分解，降低痰的粘滞性。NAC还可刺激呼吸道纤毛运动，刺激胃肺迷走神经反射，从而促进黏液的清除。氧化物的增加及抗氧化物的减少与吸入性损伤发病过程密切相关，而NAC本身就是一种直接的抗氧化物，能清除羟自由基（OH）、过氧化氢以及次氯酸等。有研究表面，NAC能抑制TNF-α的激活，阻断炎前性细胞因子的启动，从而阻断上皮细胞和巨噬细胞释放炎症因子。此外，NAC还能通过抑制过氧化氢对肺泡上皮细胞NF-kB的活化，减少IL-6的产生与表达，抑制中性粒细胞在肺的聚集[8]。王雯等研究表明，雾化吸入NAC能有效缓解患者咳嗽及呼吸困难症状，显著改善患者动脉血氧分压等[9]。笔者课题组在应用NAC治疗烟雾吸入所致大鼠急性肺损伤模型中观察到，NAC可以明显提升动脉血氧含量，改善肺组织干湿重比，从而减轻了肺水肿。

本研究结果表明，NAC能够有效的抑制相关炎症因子的释放，使中性粒细胞在肺部聚集、活化减少，降低了氧自由基的产生，具有明显的抗炎作用。提高NAC的给药剂量至本次研究中所用高剂量（300 mg/kg）后保护效果明显增强，表明NAC对吸入性肺损伤的保护作用与其在体内生成还原性物质的数量有一定关系。

综上所述，N-乙酰半胱氨酸对大鼠烟雾吸入所致急性肺损有保护作用，能够有效减轻大鼠肺水肿及炎症反应。

参考文献：

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