宫颈脱落细胞miR—125b与宫颈病变关系及其在HR—HPV阳性患者分层筛查中的作用研究

NEELAMSAH 聂小凤 张琴

摘 要：目的 比較正常宫颈、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌患者宫颈脱落细胞中miR-125b表达水平差异，探讨宫颈脱落细胞miR-125b表达水平检测在HR-HPV阳性患者分层筛查中的作用及其与宫颈病变的关系。方法 采用第二代杂交捕获技术进行HR-HPV初筛，HR-HPV阳性患者行宫颈液基薄层细胞学检查及miR-125b检测。液基细胞学检查结果异常者直接阴道镜下活检行病理学检查，液基细胞学检查正常者行阴道镜检查，阴道镜检查下发现异常者行阴道镜下活检取材，余视作宫颈组织学正常，不做宫颈活检。RT-qPCR检测正常宫颈及不同级别宫颈病变中miR-125b表达水平，比较不同组织学分组之间的宫颈脱落细胞miR-125b表达水平，绘制ROC曲线，探讨miR-125b、液基细胞学检查在宫颈病变中的诊断作用。结果 宫颈脱落细胞miR-125b水平随着宫颈病变程度加重逐渐升高（P<0.05）；在HR-HPV阳性患者分层筛查中，宫颈液基细胞学诊断宫颈高级别上皮内病变的敏感性、特异性分别为64.90%、80.70%，AUC为0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001）。与液基细胞学检查相比，宫颈脱落细胞miR-125b检测诊断宫颈高级别上皮内病变的灵敏性、特异性更高（87.30% vs 64.90%；69.20% vs 80.70%），AUC为 0.864（95%CI：0.800～0.928，P<0.001）。结论 miR-125b水平随着宫颈病变加重逐渐升高，检测宫颈脱落细胞miR-125b水平可有效分流HR-HPV阳性患者，敏感性高于细胞学检查，可能成为一种有效的分层筛查方法。

关键词：宫颈病变；miR-125b；HR-HPV；宫颈癌筛查

中图分类号：RR737.33 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.23.021

文章编号：1006-1959（2018）23-0076-04

Abstract：Objective To compare the expression levels of miR-125b in cervical exfoliated cells of normal cervix， cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer， and to explore the role of miR-125b expression in cervical exfoliated cells in stratified screening of HR-HPV positive patients. The relationship between cervical lesions. Methods The second-generation hybridization capture technique was used for HR-HPV screening. The HR-HPV-positive patients underwent cervical-based thin-layer cytology and miRNA125b detection. The results of liquid-based cytology were abnormal. The pathological examination was performed directly under biopsy. The liquid-based cytology was performed by colposcopy. The abnormalities were found under colposcopy. The colposcopy biopsy was performed. Normal， no cervical biopsy. RT-qPCR was used to detect the expression of miR-125b in normal cervical and different grades of cervical lesions. The expression levels of miR-125b in cervical exfoliated cells were compared between different histological groups. ROC curves were drawn to investigate miR-125b and liquid-based cytology. The role of diagnosis in cervical lesions. Results The level of miR-125b in cervical exfoliated cells increased with the severity of cervical lesions （P<0.05）. In the stratified screening of HR-HPV positive patients， the sensitivity of cervical liquid-based cytology in the diagnosis of high-grade intraepithelial lesions of the cervix， The specificities were 64.90% and 80.70%， respectively， and the AUC was 0.728 （95% CI： 0.657～0.779，P<0.001）. Compared with liquid-based cytology， the sensitivity and specificity of cervical exfoliated cells miR-125b for the diagnosis of high-grade intraepithelial lesions of the cervix were higher （87.30% vs 64.90%； 69.20% vs 80.70%）， and the AUC was 0.864 （95%CI： 0.800～0.928，P<0.001）. Conclusion The level of miR-125b is gradually increased with the increase of cervical lesions. The detection of miR-125b in cervical exfoliated cells can effectively divert HR-HPV positive patients， which is more sensitive than cytology and may be an effective stratified screening method.

Key words：Cervical lesions；miR-125b；HR-HPV；Cervical cancer screening

宮颈癌（cervical cancer，CC）是发展中国家女性常见的恶性肿瘤，发病率高且逐年上升[1]，其发生一般需经历从正常宫颈上皮到不同级别癌前病变的演变过程，平均需5～20年[2]。宫颈癌虽发病率高但其病程进展缓慢，加之宫颈位置易于被暴露和取材，因此是目前唯一可以通过筛查降低浸润癌发生率的恶性肿瘤。宫颈上皮内瘤变（CIN）是宫颈癌前病变，通过筛查及时发现宫颈上皮内瘤变，及时治疗，是预防宫颈癌的有效措施。高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）检测和宫颈细胞学检查是目前最主要的两种宫颈癌筛查方法。HPV检测具有敏感性高，阴性预测值高，结果客观可靠等优点，但HPV检测的最大局限性是阳性预测值低，因此，可能导致阳性妇女产生不必要的心理焦虑，甚至过度诊疗[3]。宫颈细胞学检查具有特异性和阳性预测值高的优点，但宫颈细胞学检查的敏感性较低，结果判断有较大的主观性，依赖于经过专业培训的病理医生[4]。因此，在HPV阳性妇女中，探索一种新的分层筛查方法具有重要意义。MicroRNAs （miRNAs）是重要的基因调节因子，在多种肿瘤中异常表达。近年来，有研究报道miRNA可作为肿瘤诊断的生物标记物[5]。在宫颈癌发生中，miR-125b因为与E6蛋白作用的靶基因p53密切相关而受到关注[6]。miR-125b水平的升高可代表HPV病毒与宿主细胞的整合，是宫颈发生病变的标识。因此，在本课题中，我们通过检测HR-HPV感染阳性患者宫颈脱落细胞miR-125b水平，探讨miR-125b在不同宫颈病变组织中的表达情况，并进一步与宫颈细胞学检查比较，探讨其在HR-HPV阳性妇女分层筛查中的作用及价值。

1资料与方法

1.1一般资料 选择2015年10月～2017年4月至昆明医科大学第二附属医院妇科进行宫颈癌筛查的就诊者30000例，本研究经医院伦理委员会审核通过。年龄25～70岁，平均年龄（37.33±5.28）岁，纳入标准：①有性生活史；②研究经患者知情同意，并签署知情同意书。排除标准：①既往已确诊患有宫颈上皮内瘤变，宫颈癌，或其他宫颈恶性肿瘤者；②宫颈不完整，既往行宫颈部分及全部切除者；③年龄<25岁，或>70岁者；④妊娠者。

1.2方法 采用第二代杂交捕获技术（Hybrid Capture 2，HC2）行宫颈HR-HPV初筛，HR-HPV阳性者行TCT及宫颈脱落细胞miRNA检查，RT-qPCR方法检测宫颈脱落细胞中miR-125b表达水平，以宫颈组织学诊断作为分组依据，比较正常宫颈组、LSIL组、HSIL组和CC组miR-125b表达水平差异。TCT结果≥ASCUS者为TCT阳性，TCT阳性者直接阴道镜下活检行病理学检查；TCT阴性者行阴道镜检查，阴道镜异常者阴道镜下活检取材。

1.2.1 HPV检测 由经过培训的妇科医生取样，用HPV采样器于宫颈管内，同一方向旋转3周，置于样品保存液中，4 ℃保存待检测。采用HC2检测高危型HPV，具体检测方法参照生产商的说明。共检测14种高危型HPV，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68。其结果以标本的相对荧光光度值（RLU）与阳性定标的域值（CO）的比值表示，RLU/CO≥1.0为阳性，反之RLU/CO<1.0为阴性。

1.2.2 TCT检测 由经过培训的妇科医生取样，应用液基细胞学取样器，于宫颈管内旋转 3～5 圈，将宫颈脱落细胞保存在专用的细胞保存溶液中（Cytyc Corporation）。用液基细胞学（LBC）方法行宫颈细胞学检查。用ThinPrep 2000 processor（Cytyc Corporation）进行液基细胞制片。由本院病理科医生读片并做出病理学诊断，宫颈细胞学检测按照 TBS 分级系统评价标准分类，TCT 结果≥ASCUS者为TCT阳性，反之则为阴性。由2位病理学医师独立阅片，当诊断结果不一致时，通过讨论得出一致诊断意见。

1.2.3 miR-125b检测 由经过培训的妇科医生取样，方法与TCT取样相同，用宫颈细胞取样专用软毛刷收集宫颈脱落细胞，样本保存于Trizol商品化试剂盒，Trizol法提取细胞中总RNA，按照试剂盒说明，应用RT-qPCR法检测miR-125b表达，以U6作为内参，用2-ΔCt表示miRNA的相对表达水平，2-ΔCt数值越大表示对应的miRNA相对表达水平越高，2-ΔCt数值越小表示对应的miRNA相对表达水平越低。

1.2.4组织学诊断 宫颈活检获取的宫颈组织进行常规石蜡包埋、切片、制片，经染色后，由2位病理学医师独立阅片，当诊断结果不一致时，通过讨论得出一致诊断意见。诊断依据采用2014年第四版WHO女性生殖器官肿瘤分类标准，将疾病分为两个级别：LSIL和HSIL[7]。当患者活组织检查结果同时存在多级别宫颈病变时，则按最高级别入组。

1.3统计学处理 采用SPSS 22.0软件包完成。Mann-Whitney U检验分析比较正常宫颈组和LSIL组，LSIL组和HSIL组，HSIL组和CC组miR-125b表达水平差异，以（x±s）表示。构建ROC曲线，分析TCT及miR-125b检测在HSIL及以上病变诊断中的价值，根据最大约登指数确定miR-125b在诊断HSIL及以上病变的cut off值，比较TCT与miR-125b诊断HSIL的敏感性、特异性。P<0.05 为差异有统计学意义，P<0.001表示统计学意义极显著。

2结果

2.1宫颈筛查及活检情况 30000名女性参加HPV-DNA检测的初筛，其中1140例HPV阳性，最终595例女性完成了TCT和miRNA检测，其中90例女性TCT结果异常，505例TCT结果未见异常行阴道镜检查，结果正常303例、异常202例，最终共292例行阴道镜下活检，正常189例，LSIL 29例，HSIL 71例，CC 3例。

2.2宫颈脱落细胞miR-125b表达水平检测结果比较 随着宫颈病变程度的增加，miR-125b的表达水平逐渐增高，与正常组及LSIL组相比，HSIL组与CC组均增高（P<0.05），见表1。

2.3 TCT结果与宫颈病变的关系 HSIL组、CC组TCT阳性率高于LSIL组、正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4 TCT结果对HISL的诊断作用 TCT结果对诊断HISL的灵敏度为64.90%，特异度为80.70%，AUC为0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001），见图1。

2.5 miR-125b对HISL的诊断作用 miR-125b对诊断HISL的灵敏度为87.30%，特异度为69.20%，AUC为0.864（95%CI：0.800～0.928，P<0.001），cut off值为0.565，见图2。

3讨论

微小RNA（ microR-NA，miRNA） 是一类内源性的非编码单链小分子RNA，长度约为 18～25个核苷酸，可与靶信使 RNA（ mRNA） 3'端非翻译区（ 3'-UTR） 互补配对结合，进而引起靶mRNA降解或翻译抑制，调控基因表达，是一类重要的基因转录后调节因子，广泛参与细胞调亡、增殖、分化等多种重要生物学过程[8]。miR-125b是p53基因的负性上游调节因子，miR-125b表达增加将导致p53途径的失活，因此，导致p53依赖的凋亡激活降低，细胞避免G1期阻滞和DNA修复，细胞不稳定性增加。另外，miR-125b与HPV-L2具有很高的同源性，可以参与病毒DNA合成，促进病毒繁殖，具有病毒基因组的细胞将保持存活状态，导致HPV基因组重组风险的增加，导致癌前病变风险的增加[9]，因此，miR-125b可能用于识别HR-HPV的持续感染和宫颈病变进展的妇女。

本研究发现，miR-125b在宫颈癌和高级别宫颈上皮内病变中的表达水平高于其在正常宫颈及低级别宫颈上皮内病变中的表达，且miR-125b值隨着宫颈病变加重逐渐升高，提示miR-125b在HSIL预测中发挥一定的作用。在对HSIL预测中，miR-125b检测与TCT相比较，诊断宫颈病变的敏感性更高（87.30% vs 64.90%），且AUC高于TCT[0.864（95%CI：0.800～0.928，P<0.001）vs 0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001）]。提示miR-125b检测作为生物标记物用于宫颈癌筛查中HPV阳性的妇女的有效分流的潜在临床价值，值得进一步研究。本研究的不足之处为研究对象来源于医院的妇科门诊患者，而不是普通人群，这就不可避免地造成了病例构成上的偏倚，因此，本研究的结果需要在一个大样本普通人群中进一步研究验证。其次，我们的研究当中最终进行宫颈活检的有效病例仅292例，活检病理示正常189例，LSIL 29例，HSIL 71例，CC 3例，样本量偏少，研究结果的可靠性需要大样本的研究加以验证。

综上所述，宫颈脱落细胞中miR-125b检测在对HR-HPV阳性妇女分层筛查时的敏感性优于宫颈细胞学检查，进一步提高了分层筛查价值。但本研究结果是基于到医院就诊的妇女人群，且样本量偏少，因此，我们的研究结果需要在一个较大样本的普通人群中进一步研究证实。

参考文献：

[1]Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015[J].CA Cancer J Clin，2016，66 （2）：115-132.

[2]田其芳.宫颈脱落细胞microRNA检测在宫颈癌筛查中的作用[D].浙江大学，2014.

[3]王晴，张蓓，印泽远，等.HPV分型定量检测对宫颈病变的预测价值[J].现代妇产科进展，2018，27（5）：351-354，358.

[4]杭国红.薄层液基细胞学检查、高危型HPV-DNA检测联合宫颈脱落细胞p16蛋白检测在宫颈癌早期筛查中的价值[J].中国妇幼保健，2017，32（22）：5569-5571.

[5]郭金满，胡火军，谭园.微小RNA检测方法在临床诊断中应用的研究进展[J].广东医学，2015，36（5）：809-811.

[6]Nuovo GJ.Strong inverse correlation between microRNA-125b and human papillomavirus DNA in productiveinfection[J].Diagn Mol Pathol，2010，19（3）：135-143.

[7]沈丹华，陈定宝.解读第4版WHO女性生殖器官肿瘤分类中的变化[J].中华妇产科杂志，2014，49（9）：717-720.

[8]Treiber T，Treiber N，Meister G.Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2018（18）.

[9]Ribeiro J，Sousa H.MicroRNAs as biomarkers of cervical cancer development： a literature review on miR-125b and miR-34a[J].Mol Biol Rep，2014，41（3）：1525-1531.

收稿日期：2018-9-28；修回日期：2018-10-09

编辑/肖婷婷