EGFL7在乳腺癌中的研究进展

阙海涛 曹斌 秦志刚

摘 要：表皮生长因子样结构域7是表皮生长因子样蛋白家族的成员，是一种极为关键的血管生成因子和血管发育调节因子，在不同类型细胞中均有表达。EGFL7在早期胚胎的血管中表达较高，主要调节发育过程中的血管生成，促进内皮细胞增殖，形成有功能的血管网，促进组织增长和再生。与其在胚胎期较强的表达相比，在成人体内的表达量微乎其微，异常高表达的EGFL7常在多种恶性肿瘤中出现。目前越来越多的证据表明，EGFL7可调节肿瘤血管生成、促进肿瘤转移和侵袭。肿瘤组织中EGFL7高表达常常提示肿瘤生长和转移较为活跃及不良的预后。近年来，一系列研究表明，EGFL7的表达与乳腺癌的发生发展、转移过程密不可分，且在提示预后方面发挥着关键作用。本文就EGFL7在乳腺癌中的研究进展作一综述，为临床诊断及治疗提供新思路。

关键词：表皮生长因子样结构域7；乳腺癌；肿瘤诊断

中图分类号：R737.9 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.23.010

文章编号：1006-1959（2018）23-0032-05

Abstract：Epidermal growth factor-like domain 7 is a member of the epidermal growth factor-like protein family and is a critical angiogenic factor and vascular developmental regulator that is expressed in different cell types. EGFL7 is highly expressed in the blood vessels of early embryos， mainly regulating angiogenesis during development， promoting endothelial cell proliferation， forming a functional vascular network， and promoting tissue growth and regeneration. Compared with its strong expression in the embryonic stage， the expression level in adults is negligible， and abnormally high expression of EGFL7 is often found in many malignant tumors. There is increasing evidence that EGFL7 regulates tumor angiogenesis， promotes tumor metastasis and invasion. High expression of EGFL7 in tumor tissues often indicates a more active and poor prognosis of tumor growth and metastasis. In recent years， a series of studies have shown that the expression of EGFL7 is inseparable from the occurrence and development of breast cancer， and plays a key role in prognosis. This article reviews the research progress of EGFL7 in breast cancer， and provides new ideas for clinical diagnosis and treatment.

Key words：Epidermal growth factor-like domain 7；Breast cancer；Tumor diagnosis

乳腺癌（breast cancer）是一种常见于女性的恶性肿瘤，且在我国的发病率逐年上升，已跃居我国女性癌症发病率首位，其引发的病死率居第6位且仍呈上升趋势，严重危及女性健康[1，2]；而探索乳腺癌的发病及进展机制，寻找潜在的诊断及治疗靶点，愈发成为众多课题组的研究热点。表皮生长因子样结构域7（epidermalgrowthfactor-likedomain 7，EGFL7）又称为Notch4-lik、VE-stain、Neul，其主要由上皮织分泌，亚细胞定位分析位于胞浆与胞膜[3]，作为关键血管生成因子和细胞膜受体的重要调节因子，在许多组织中都有表达。研究显示它在多种肿瘤如鼻咽癌、胃癌、肾透明细胞癌、结直肠癌、口腔癌和食道癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、肺癌等腫瘤血管的管腔形成、功能完善上发挥着重要作用[4-8]。近年来，越来越多的研究发现，EGFL7与乳腺癌的发生及进展密切相关，分析EGFL7在乳腺癌发生、发展中的变化与机制，有望使其成为乳腺癌预后诊断的标志物以及治疗新靶点。

1 EGFL7的结构特点、生物学功能和表达

1.1 EGFL7的结构特点 EGFL7作为一个在血管内皮特异性表达基因，在2003年和2004年分别被两个实验室独立发现，且分别命名为VE-stain和EGFL7[9，10]。哺乳动物的EFGL7基因高度保守，使用荧光原位杂交技术（FISH）显示其位于人和小鼠的9号染色体（9q34.3）和2号染色体（2A3）上，分别编码29.629.6kDa蛋白质（273个氨基酸）和29.8 kDa（275个氨基酸）蛋白质。首次检测到该蛋白质在胚胎的血管结构中特异表达，促进新生血管的塑形、发育。在结构上，从氨基酸到羧基端依次分为：一个N末端信号肽、一个富含半胱氨酸的EMI结构域、两个位于中心的EGF 重复结构域、细胞附着位点（Arg-Gly-Asp） （RGD）基序和卷曲螺旋[3，4，9]。

1.2 EGFL7的生物学功能 N末端信号肽提示EGFL7是一种分泌性蛋白，主要定位于内质网及高尔基体等分泌功能细胞器。而富含半胱氨酸的EMI结构域则参与调节细胞间粘附的作用。上述两个结构域与细胞外基质结合蛋白极为相似，例如弹性蛋白微纤维界面定位蛋白（EMILIN）和层粘连蛋白，可推测其与细胞间的粘附、移动功能极为相关[11]。位于中心的两个EGF 重复结构域，其中一个的结构域组成与Delta-Serrate-LAG-2结构域同源，可参与蛋白质与Notch受体的相互作用[12]，而另一个EGF样结构域与Ca2+结合，调节蛋白质的结构变化，从而发挥功能[9]。EGFL7的分泌受其他ECM蛋白的影响。例如，纤连蛋白和1型胶原，新生血管侵入新组织时遇到的ECM蛋白能够促进EGFL7的沉积[13]。EGFL7调节血管内皮细胞活性的能力与其结构性EGF样结构域一致，这是许多已知为血管生成因子的EGF样蛋白的关键特征，包括但不限于EGF，肝素结合性表皮生长因子（human proheparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF），转化生长因子α（TGF-α）和EGFL6[14]。

1.3 EGFL7的表达 为了检测EGFL7在人体细胞，组织和器官中的差异性表达，研究者查阅了BioGPS基因表达谱发现，EGFL7的表达在CD34+细胞，CD105+内皮细胞，心肌细胞，胎儿和成体肺，胎儿甲状腺，平滑肌，胎盘和心脏中最高。此外，EGFL7的基因表达受转录调节机制控制并且严格限于内皮细胞[9，10，15，16]。上述研究还发现，在早期胚胎的发生过程中，于胚外中胚层中检测到了EGFL7mRNA表达，并且证明其在内皮细胞分化，建立脉管系统的过程中起关键作用。在整个胚胎发育过程中，EGFL7的表达与胎肝激酶-1（fetal liver kinase-1，flk-1）的表达趋势相一致，而flk-1是胚胎发育期间早期血管祖细胞的特异性标记物，EGFL7的表达甚至还要早于flk-1[9]。值得注意的是，EGFL7在除高度血管化的组织，如肺脏、心脏、子宫和卵巢的其他成年个体组织中的表达微乎其微，这些研究表明EGFL7可能在介导血管形成中起关键作用。实际上，随后的研究表明EGFL7可以促进内皮细胞迁移和血管结构形成，发芽和侵袭[16]。肿瘤组织以血管丰富，易于转移播散为特点，以此为出发点，接下来的一系列研究集中于EGFL7在肿瘤中的表达，探究EGFL7作为血管形成的关键调控分子是否也参与其中。结果发现，与正常组织中极低的水平相比，EGFL7在多种肿瘤如肝癌、肺癌、乳腺、垂体腺瘤、卵巢癌、子宫内膜、胃癌、膀胱癌、鼻咽癌等细胞内高表达[17-21]，且有研究指出其与部分肿瘤（肝癌、胶质瘤、卵巢癌、乳腺癌、胃癌）TNM分期及预后密切相关[20-25]，EGFL7在保护内皮细胞免受应激诱导的细胞凋亡中也发挥着作用[26]。因此，EGFL7具有作为新型肿瘤标志物的可能，预测肿瘤的恶性程度及预后。

2 EGFL7在乳腺癌中的研究现状

原发性乳腺癌是一典型的多血管肿瘤，如前所述，EGFL7在胚胎时期与血管管腔的生成和塑形密切相关，成年个体仅有大量血管新生的组织可出现表达上调，如妊娠期的子宫和炎症组织等。而多种肿瘤细胞都高表达EGFL7，这种独特的表达方式表明 EGFL7可能与肿瘤血管的生长和塑型相关。

2.1 EGFL7与乳腺癌恶性程度 刘志勇等[27]较早地利用动物模型探究EFGL7与乳腺癌的关系，检测到种植瘤组织中EFGL7在mRNA转录水平表达显著升高，免疫组织化学示血管内皮生长因子（VEGF）、血小板反应蛋白（TSP1）等强阳性表达，提示血管生成极为旺盛。在使用shRNA沉默种植瘤细胞EGFL7后，瘤体显著减小，微血管密度显著降低。VEGF及TSP1由强阳性转为弱阳性或者阴性。提示EGFL7在乳腺种植瘤的血管生成中起着极为重要的作用，并提出了MMP-2/TIMP2及VEGF/TSP1两种可能的信号机制。

介于mRNA水平检测的不稳定性，其他研究者使用更为可靠的免疫组织化学方法对比了EFGL7在正常人体上皮组织及相对应来源的肿瘤组织表达水平，并进行了内源性EFGL7蛋白的亚细胞定位[28，29]。发现EFGL7大多分布于细胞质中，这与其分泌性蛋白的特征相符合。研究者观察到EGFL7在人上皮肿瘤组织中显著上调，表明EGFL7是人类上皮肿瘤，特别是肝细胞癌和乳腺癌的潜在生物标志物。乳腺组织在生理正常状态和癌变状态下EFGL7表达差距悬殊，在乳腺癌中其表达显著强于正常乳腺组织。而EGFL7的过表达与乳腺癌转移和预后不良相关的临床病理特征显著相关，如TNM分期，淋巴转移，ER和Her2阳性率[30]。一项囊括了211例乳腺癌患者的臨床研究发现[28]，样本中蛋白和转录物的检测显示EFGL7在乳腺肿瘤细胞中极高地表达。在活检组织免疫组织化学检测中，低分化的乳腺癌细胞常表现为EFGL7强阳性且更易转移，且分化程度与阳性等级密切相关。EFGL7表达在浸润性导管癌中明显高于浸润性小叶癌，在浸润性导管癌亚群中，EFGL7转录物的表达与SBR评分和ER 状态相关。在淋巴结中，EFGL7的水平与原发病灶的组织学类型相关，乳腺导管癌中检出的比例比在小叶癌中更高。最近的一项研究分别检测了EGFL7及β-catenin蛋白在93例乳腺癌组织（包含淋巴结转移病例及远处转移病例）与54例乳腺纤维腺瘤和腺病组织中的表达以及血清中EGFL7蛋白水平[29]。结果发现与乳腺纤维腺瘤和腺病等良性组织病变相比，GFL7蛋白在乳腺癌组织中的表达远远高出。EGFL7蛋白表达水平与乳腺癌淋巴结和远处转移呈正相关，发生淋巴结和远处转移的乳腺癌患者血清中EGFL7蛋白水平高于无转移的乳腺癌及乳腺纤维腺瘤和腺病组织，而伴有远处转移的乳腺癌与只伴淋巴结转移的乳腺癌病例在血清EGFL7蛋白水平比较并无差异。

研究者分析了相关患者的随访资料后发现，具有高EGFL7表达的乳腺癌患者的预后实际上也比具有低EGFL7表达的患者更差[30]。重要的是，采用多变量Cox回归分析表明，高EGFL7表达乳腺癌患者预后的独立危险因素，提示EGFL7可能是这种头号女性恶性肿瘤的有效预后标志物。

2.2 EFGL7与免疫逃逸 肿瘤的侵袭转移过程中为了应对宿主免疫系统的免疫应答，往往伴随着免疫逃逸，其中的机制各不相同。Delfortrie S等[32]首次发现了EFGL7参与乳腺癌免疫逃避的现象，初步证明EGFL7可通过抑制血管内皮细胞活化，阻止免疫细胞进入肿瘤块，从而庇护肿瘤细胞免受免疫系统攻击。首先他们发现，将EGFL7在乳腺癌中过度表达可以促进免疫功能正常小鼠的肿瘤生长和转移，但在免疫缺陷小鼠中并未观察到此现象。随后他们检测了肿瘤血管内皮中ICAM-1和VCAM-1这两种促进免疫细胞附着和浸润的关键内皮粘附分子水平，发现增加EGFL7表达后，上述两种分子显著下调，同时下降的还有免疫刺激细胞因子IFN-γ，IL-12，但是EFGL7本身并不会直接影响免疫细胞的应答活性。在瘤体组织染色切片中发现，高表达EFGL7的肿瘤组织中炎细胞浸润较差。由此可见，EGFL7主要通过降低介导免疫细胞浸润的内皮分子的表达，阻止免疫细胞通过，促进肿瘤的进展。继动物实验之后，最新的研究检测了人乳腺癌瘤周血管中EGFL7的表达水平和作为内皮激活的标志物的ICAM-1的表达水平[24]，该研究将来自2005年治疗的204名患者的乳腺癌样品（174名侵入性和30名原位）对CD31，ICAM-1进行免疫染色，并使用原位杂交对EGFL7进行染色。使用半定量尺度在肿瘤周围区域评估ICAM-1和EGFL7的表达水平。发现在CD31+血管中ICAM-1的表达与EGFL7的表达之间存在强烈且显著的负相关。进一步探究发现，EGFL7可下调ICAM-1表达，而ICAM-1在相同条件下对EGFL7表达没有影响，进一步侧面证明，EGFL7在与免疫渗透相关的内皮细胞活化中起调节作用，抑制癌旁血管内皮细胞活化，从而阻止免疫细胞通过。可作为抗癌免疫疗法的潜在治疗靶标。

3 EFGL7与miR-126

miRNA是一类含17～25个核苷酸的非编码RNA，通过靶向mRNA进行切割或转录抑制来调节基因表。在人类中，miRNA在关键细胞过程中的基因表达调节中起重要作用，例如细胞分化，细胞周期进程，应激反应和细胞凋亡等。miR-126为一种内含子衍生miRNA，EFGL7是其宿主基因，两者关系紧密。其在内皮细胞中严格表达并从EGFL7前mRNA中切除而不影响其宿主基因的剪接和表达[32]。两者的转录同时发生，成熟的miR-126与宿主基因EGFL7内的互补序列结合，阻止mRNA的翻译，导致EGFL7蛋白水平降低，起到负反馈机制的作用。微阵列杂交和基于PCR的方法检测到转移性乳腺癌细胞中miR-126水平低，而miR-126过表达降低了乳腺癌细胞的生长、体外和体内转移。此外，与健康人相比，乳腺导管癌患者的miR-126循环水平较低，复发性乳腺癌患者可检测出miR-126表达缺失，且与远端转移生存率降低有关[33]。一项荟萃分析显示，miR-126的水平也与乳腺癌的组织学分级和性激素受体状态相关[34]。以上这些发现我们可推测，EFGL7作为miR-126的宿主基因，在乳腺癌的发生与进展过程中两者关系十分微妙，其中具体调控机制有待进一步研究，可为乳腺癌治疗提供新的思路。

4总结与展望

血管生成在介导胚胎发生，器官发生和维持组织稳态中起重要作用。然而，血管生成因子调节的破坏常常导致血管生成异常。这在癌组织中最常见，其中不受控制的肿瘤血管生成可以为肿瘤组织提供营养并促进其生长。缺乏早期醫疗干预，导致附近的组织/器官继发性肿瘤的形成，是癌症蔓延进而导致死亡的主要原因。因此，研究在生理条件和癌症存在情况下血管生成因子的调节机制至关重要。不同的研究已经描述了EGF样家族成员在血管生成中的新兴作用。

EGFL7是已知的在胚胎发生过程中调节内皮细胞活性和脉管系统形成的关键分子，可以促进乳腺癌血管的形成和塑形，增加其侵袭和持续增长的潜力。此外，EFGL7还可通过调节内皮细胞功能，阻止免疫细胞的迁徙和侵袭，从而协助乳腺癌进行免疫逃避。作为在肿瘤生长过程中如此重要的分子，针对EGFL7进行靶向癌症治疗似乎有一定的前景。这种只对少数敏感者产生治疗结果的现象，可能与EGFL7靶向治疗的肿瘤特异性有关。因此，涉及EGFL7作为治疗靶标的未来临床实验的设计和实施可能需要剂量优化和药效学生物标志物开发。此外，miR-126作为EFGL7内含子衍生的miRNA，在乳腺癌的发生与进展过程中亦体现出较为密切的相关性，这也为EGFL7靶向肿瘤治疗提供了一个新的可能。因此，继续探索EGFL7的分子机制和病理作用对于利用其治疗潜力，改善预后和为患者提供更好的治疗结果极为必要。

前期大量的临床病理研究表明，乳腺癌EFGL7表达显著强于正常乳腺组织，且与TNM分期、淋巴活检结果、雌激素受体活性及Her2阳性率密切相关。这提示我们 EGFL7 可以成为肿瘤的一个病理诊断指标，从而提示恶性程度及预后。关于EGFL7参与乳腺癌发生发展中的机制则有待进一步研究，在未来仍然充满着治疗潜力。

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收稿日期：2018-9-28；修回日期：2018-10-9

編辑/肖婷婷