不同产地和不同环境生长的金线莲的ISSR遗传特性分析

赵会贤， 黄宛祯， 黄丽英

金线莲[Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl.]为兰科开唇兰属多年生草本植物，别名金线兰、金线草等，主要分布在福建、浙江、云南和台湾等地区[1]。民间以全草入药，被视为珍稀名贵药材,享有“药王”、“金草”等美称[2]。近年来的研究表明，金线莲主要含有黄酮类、核苷类、多糖类、生物碱、微量元素等几大类物质[3]，其经济价值和药用价值日渐受到重视，因而造成了人为的过度采摘，加上其对生态环境要求严格，野生金线莲资源现已濒临灭绝[4]。更有不法商家用斑叶兰或其他廉价兰科植物冒充金线莲以换取高额利润。因而，迫切需要一种可以用于鉴别金线莲的技术手段[5]。随着分子生物学技术在中药学领域逐渐渗透与发展[6]，基于分子标记的限制性片段长度多态性技术(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphism DNA,RAPD)、简单序列重复(inter-simple sequence repeat,ISSR)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)等鉴定方法已成为中药四大鉴定方法的重要补充[7-10]。ISSR是以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和电泳为核心的分子标记技术，不需要再复杂地构建基因文库、杂交和同位素显示等步骤，实验简单快速,多态性高，重复性好[11]。

目前，关于金线莲ISSR分子标记的研究仅见3篇文献报道[12-14]，且多是对金线莲的产地或与近缘种植物的差异性进行研究。本研究采用ISSR分子标记技术，对来自福建省内不同种类、不同产地、不同生长方式的金线莲进行研究，尝试从分子水平上对其亲缘关系进行区分，同时探讨组织培养的金线莲、种植金线莲和野生金线莲的遗传特性差异。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1样本 20份样本材料均于2017年3-4月购自福建省内的不同地区，经福建医科大学药学院天然药物化学学系张永红教授鉴定为金线莲药材。取样时，均选取健康无病虫害植株顶端的前三片嫩叶作为实验材料。样本信息及编号如表1所示：

表1 不同金线莲供试材料

1.1.2主要试剂 液氮；植物基因组DNA提取试剂盒(批号：DP022，GeneMark)；酶、碱基等混合物Premix TaqTM(批号：RR901A，日本Takara公司)；核酸染料Gold view(批号：DH392-5，北京鼎国昌盛生物技术有限公司)；DNA Marker(300～5 000 bp，批号：111108-50，北京天恩泽生物技术有限公司)；100 bp梯度DNA Marker(100～3 000 bp，批号：SM0321,Thermo Scientific)。

1.1.3主要仪器 涡旋震荡仪(IKA Vortex Genius 3，杭州雷琪实验器材有限公司)；高速冷冻离心机(Neofuge18R，力康发展有限公司)；电子天平(BS124S，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S，巩义市予华仪器有限责任公司)；超微量分光光度计 (Nanodrop2000 Spectrophotometer，Thermo Scientific)；PCR扩增仪(T100TM Thermal Cycler，美国BIO-RAD公司)；凝胶成像系统(Gel Doc XR+，美国BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1基因组DNA的提取与检测 选用植物基因组DNA提取试剂盒分别提取20个样本的DNA。用超微量分光光度计检测其浓度及纯度，再用1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的质量、大小和完整性，保存于-20℃冰箱中备用。浓度及纯度检测结果如表2所示：20份样本材料的基因组DNA的纯度值A260/280近似分布在1.7～1.9，符合实验需求[12]，可用于后续操作。

1.2.2PCR引物工作液的制备 根据哥伦比亚大学公布的96条ISSR引物序列，参考文献[13-15]，优选出30条，由上海生工公司合成。将30条引物干粉经高速冷冻离心机(5 000 r/min，25 ℃,10 min)离心后小心开盖，按照瓶身标注加入指定体积的ddH2O，制备30种引物的工作液，使其浓度均为10 μmol/L。

1.2.3ISSR-PCR反应体系及扩增程序的优化 参照文献[12,16]，设计针对本实验的流程及参数。优选出18号金线莲样本的基因组DNA，对ISSR-PCR体系中的模板和引物加入量、反应体积、反应循环数、退火温度等进行优化。本实验使用Premix Taq溶液，使用时只需在制品溶液中加入模板和引物便可进行PCR反应。优化的最终条件为：反应体积25 μL，其中包括模板DNA 1 μL(约40 ng)，引物1 μL(10 μmol/L)，ddH2O 10.5 μL，2×Premix Taq 12.5 μL。

表2供试材料的基因组DNA浓度及纯度

Tab2The genomic DNA concentration and purity of the tested samples

编号100 μL洗脱液定容ρDNA(μg·mL-1)纯度A260/28050 μL洗脱液定容ρDNA(μg·mL-1)纯度A260/280135.51.8169.31.77242.31.7878.21.77334.31.7774.11.80427.71.7766.11.76529.71.7862.81.74644.91.7588.51.79751.31.7987.21.80843.01.7792.71.81937.21.8157.31.821029.41.8264.41.801160.91.75120.11.851237.51.7461.41.781341.01.7793.91.801441.01.7872.41.761553.21.8298.71.831671.51.76136.41.801743.41.7579.91.801834.71.7465.71.741966.31.72111.31.732052.61.6690.01.69

PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s→50～55 ℃退火30 s→72 ℃延伸40 s；循环40次，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存[17]。

ISSR-PCR扩增产物的检测 按照优化出的反应体系扩增20个样本材料。经琼脂糖凝胶电泳成像后，最终筛选出15条多态性好，稳定性高、扩增条带清晰的引物进行ISSR遗传分析，见表3。选择0.5×TBE电泳缓冲液，在1.7%琼脂糖凝胶电泳上加入15 μL PCR扩增产物，同时以300～5 000 bp和100 bp梯度两种分子量标准作为扩增产物的分子量标记，凝胶中含有5% Gold view核酸染料。100 V电压，电泳1.5 h，凝胶成像系统检测拍照。引物UBC811的扩增结果如图1所示。

图1 引物UBC811对20个样本的ISSR-PCR扩增结果Fig 1 ISSR-PCR amplification results of 20 samples by primer UBC811

2 结 果

2.1扩增产物的多态性统计 根据20个样本的ISSR-PCR凝胶电泳图，每个清晰可辨的条带代表一个变异，在相同迁移位置上，有条带的计为1，无带的计为0，构建扩增位点矩阵。15个引物共扩增出130条带，每个引物扩增条带数如表3所示。

表3 15种引物的碱基序列及扩增条带数

2.2遗传相似系数和聚类关系分析 用NTSYS-Pc 2.1和POPGENE32聚类软件，非加权配对算术平均法(unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA)进行聚类分析，得到样本间的遗传相似系数和遗传距离矩阵如表4所示。由表4可知，19和20号样本间遗传相似系数为1，遗传距离为0，其余金线莲样本材料间遗传相似系数在0.647 6～0.971 4范围内变化，遗传距离在0.029 0～0.434 5范围内变化。其中3号和4号样本遗传相似系数最大，为0.971 4；遗传距离最小，为0.029 0，表明二者之间具有较近的亲缘关系。13号样本(南靖习礼尖叶组培金线莲)与19和20号样本(三明永安野生金线莲)遗传相似系数最小，为0.647 6，遗传距离最大，为0.434 5，说明13号样本与二者的亲缘关系较远。

基于ISSR-PCR扩增位点统计矩阵，选用UPGMA方法进行聚类分析，构建福建金线莲样本间聚类关系如图2所示。用POPGENE 32软件分析得：平均观察等位基因数为1.619 0，平均有效等位基因数为1.374 8，平均Nei's遗传多样性指数为0.215 9，平均Shannon信息指数为0.322 0，多态性比率为61.90%[18]，扩增条带的分子量大多位于300～2 000 bp。聚类分析结果最低相似系数为0.73，最高相似系数为1。当相似系数取0.78时，可将20个金线莲样本分为3类。

UPGMA：非加权配对算术平均法.图2 供试样本间UPGMA聚类关系图Fig 2 The UPGMA clustering map of the tested samples

3 讨 论

对PCR反应体系优化时，选取每一类别中具有代表性的样本，与优选的引物在初始条件下进行扩增，最终扩增效果最佳的为18号金线莲样本和UBC811引物。在此条件下，筛选出15种ISSR引物对20份样本材料进行遗传多样性分析，通过提取高纯度的基因组DNA、优化最佳的PCR反应体系和扩增程序、统计扩增的多态性位点，最终获得样本间的遗传相似系数和亲缘关系图。结果表明，相同种类、相同产地的金线莲大多可以聚为一个类群，且二者对样本间遗传差异性的影响超过由生长方式引起的差异。如聚类关系图中的第一类，其中1，2，7，8，17号样本均是种类为红霞的金线莲，表明同一个种类的样本具有较近的亲缘关系；第二类为标号为3，4，5，6，10，11，12 的样本类群主要是产地为三明永安的金线莲。11和12号样本虽购自南靖，但根据厂家提供的信息，二者均源自三明，因而划分为同一类群也属合理。其中的3号金线莲为组织培养样本，4号金线莲为林下种植样本，二者遗传相似系数最大，遗传距离最小，具有最近的亲缘关系。生物的遗传是基因型和自然环境长期共同作用的结果，这表明经组织培养的金线莲在长期的生长过程中，对环境产生了适应能力，使得生长方式对其遗传变异的影响逐渐减弱。第三类中的19和20号样本均为三明永安野生金线莲，分析结果显示二者相似系数接近于1，其形态学主要区别为叶片有无明显的金色叶脉，推测二者最初可能源自同一个品系，后来表达了不同的表型性状，这也表明本实验采取的分析方法具有较高的实用性和可信性。

ISSR技术作为一种鉴别种质资源亲缘关系的有效和实用工具，具有较高的多态性。金线莲作为一种名贵中草药，福建是其主要产区，省内种植户相对较多。本研究采用ISSR技术进行金线莲的遗传特性研究，对于日后福建省金线莲的培育种植、资源保护、药物开发及药材市场的治理都具有重要的意义，同时也为野生金线莲资源濒临灭绝的现状提供了新的思路。后期将在此实验基础上继续深入研究不同种类、产地及生长方式对金线莲中一些重要化学成分和药效的影响。