冷等离子体种子处理对铜胁迫下小麦种子萌发与幼苗生长的影响

邓 敏，赵 玲，滕 应*，刘 方，徐勇峰，3，任文杰，孟 珂，3，马文亭

（1.贵州大学资源与环境工程学院，贵阳 550025；2.中国科学院土壤环境与污染修复重点实验室，南京土壤研究所，南京 210008；3.中国科学院大学，北京 100049）

目前，我国农田土壤重金属污染严重[1]，其中铜（Cu）是我国《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》[2]列出的8个重金属污染元素之一。Cu离子具有易迁移性、高蓄积性、持久性等特点[3]，易于通过食物链的生物放大给人类及其他动物健康带来潜在危害[4-5]。2014年《全国土壤污染调查公报》公布了我国土壤中Cu的点位超标率达到2.1%[6]。Cu在土壤中的正常含量一般在20～30 mg·kg-1之间，但是在污染严重的地区，如铜矿区附近[7]，Cu浓度超过了5000 mg·kg-1，远远超过土壤环境质量标准[2]。Cu虽然是植物体内许多关键酶的辅基，也是植物生长发育所必需的营养元素之一[8-10]，但是过量的Cu会抑制根系生长，对植物萌发和幼苗生长造成影响[11]。研究发现，低浓度Cu（≤50 mg·L-1）可促进小麦种子萌发和幼苗生长[12]，而高于50 mg·L-1时[13]，根的生长会受到明显的抑制，更高浓度（300～500 mg·L-1）时，根的生长只停留在瘤状物阶段，呈黑色或焦黄。通常，Cu离子主要积累在植物的根系，不易向地上部分转移。因此，Cu含量过高时，植物首先受损的是根系，最严重的也是根系[8]。

小麦作为我国重要粮食作物，种子萌发时期幼苗的生长状况对作物生长及产量有重要的影响[14]，因而提高小麦种子在萌发时期对重金属的耐受性，缓解重金属对小麦种子萌发时期的毒害作用就显得尤为重要。传统的种子处理技术有γ射线、激光、电场、磁场等[15-21]，但上述物理源在实际应用过程中，还存在一定的局限性，如设备要求高或对环境造成一定的污染等。因此有必要探索一种新的种子处理技术，以适应实际生产需求。

冷等离子体种子处理技术是近年来国际上发展的一种新型种子处理技术[22]。与传统种子处理技术相比，该技术操作简单、省时省力、处理成本低，且对环境无污染，具有非常高的农业应用价值[23-24]。经冷等离子体种子处理后的作物种子，其发芽率、幼苗生长都有显著提高[25]，能够达到增产的目的[26-27]，并且能增强作物在抗旱、抗冻及耐盐等方面的抗逆性[28]。但迄今为止，冷等离子体种子处理技术应用于提高作物抗重金属胁迫下种子萌发与幼苗生长的研究还未见报道。因此，本文以3个品种的小麦种子为研究对象，研究不同功率的冷等离子种子处理对小麦种子萌发与幼苗生长抗重金属Cu胁迫能力的影响，以期为冷等离子体种子处理技术用于提高重金属污染农田的安全生产提供理论依据和技术支撑。

1 材料和方法

1.1 实验材料

供试小麦品种苏麦188、宁麦15、苏麦128均购自江苏省农业科学研究院。CuSO4·5H2O（分析纯）购于上海金山亭新化工试剂厂。一次性塑料发芽盒规格为12 cm×12 cm×5 cm。

1.2 冷等离子体处理装置

本研究采用次大气辉光放电处理机（HPD-2400）对3种小麦种子进行处理，其放电原理如图1所示。

图1 冷等离子体放电原理Figure 1 The principle of cold plasma discharge

1.3 冷等离子体处理方法

冷等离子体种子处理功率分别为：250、500、750、990 W，处理时长为180 s[29-30]，以未经过冷等离子体处理的种子作为对照（CK）。参照鲁先文等[12]的报道，Cu胁迫浓度设为10、50、200 mg·L-1，分别代表低、中、高3个浓度。

1.4 萌发实验

种子萌发实验参照国家农作物种子检验规程发芽试验（GB/T 3543.4—1995）[31]进行，每个实验设置3个重复。具体操作：每个发苗盒铺设两层滤纸，加入不同浓度的CuSO4溶液，每个培养皿均匀摆放50粒种子，置于（25±1）℃恒温培养箱中发苗，每天观测并统计种子的发苗数（以胚苗长度达到种子长度一半为种子萌发的判断标准）。每天加蒸馏水1 mL，保证水分充分供应，培养到第7 d，测定其根长、苗长等数值。

1.5 观测项目及测定指标

1.5.1 发苗特性[32]

（1）发芽率G=7 d发苗种子数/供实验种子数×100%。

（2）发芽指数Gi=∑（Gt/Dt）

式中：Gt为t日的发苗数，Dt为相应的发苗天数。

（3）活力指数VI=发芽指数×总长。

（4）根长、苗长。

1.5.2 幼苗根、苗Cu含量测定[33]

本次实验采用湿式消解法消解：将小麦连根取出，先用自来水冲冼干净，然后用蒸馏水冲掉表面的自来水，用剪刀将根部与苗部分开，用滤纸吸干水分，在75℃条件下烘干至恒重。在研钵中分别将根、苗磨碎，用分析天平准确称取0.200 0 g上述处理后的样品，分别装入消解管中，然后向每个消解管中加入浓硝酸2.4 mL、过氧化氢0.8 mL，放入105℃烘箱中消解6 h。消解完成后，转移并定容到15 mL，然后用一次性注射器和0.45 μm滤膜过滤，将过滤后的溶液用ICP-MS测定其中Cu的含量。每组样品均进行3次平行实验。

重金属Cu转移系数和富集系数的计算公式[34]为：

转移系数=根部含量（mg·kg-1）/苗部含量（mg·kg-1）

富集系数=植物体含量（mg·kg-1）/溶液中含量（mg·kg-1）

1.6 统计分析

数据采用IBM SPSS Statistics 19软件进行ANO⁃VA统计分析，采用LSD（L）和Duncan（D）法进行方差和差异显著性检验。

2 结果分析

2.1 冷等离子处理对Cu胁迫下小麦种子发芽率和发芽指数的影响

图2反映了冷等离子处理对不同Cu浓度作用下苏麦188、宁麦15、苏麦128种子发芽率的影响。在相同冷等离子体处理条件下，Cu浓度从10 mg·L-1增加到200 mg·L-1时，苏麦188、苏麦128种子发芽率变化不显著，而宁麦15种子的发芽率整体上受到了一定的抑制，最大降幅为8.5%。冷等离子体种子处理对Cu胁迫下小麦种子发芽有一定的促进作用，但整体促进作用不大。

当Cu浓度为10、50 mg·L-1时，种子经250 W冷等离子体处理后，相比对照处理，苏麦188的发芽率有一定提高，增幅分别为3.0%和5.6%，达到了显著差异水平；经500 W冷等离子体处理后，宁麦15的发芽率相比对照提高了4.6%和4.7%，且呈现出显著性差异。

图2 冷等离子处理对Cu胁迫下3种小麦种子发芽率的影响Figure 2 Effects of cold plasma treatment on the germination rate of three wheat seeds under Cu stresses

在相同处理功率下，不同品种的小麦在Cu胁迫下的发芽率存在一定的差异。250 W的冷等离子体处理整体上对苏麦188的发芽率有一定提高，但对宁麦15、苏麦128的发芽率影响不大，甚至产生负效应。同样，500 W的冷等离子体处理对宁麦15的发芽率有一定提高，但对其他两个品种小麦的发芽无影响。

图3 冷等离子处理对Cu胁迫下3种小麦种子发芽指数的影响Figure 3 Effects of cold plasma treatment on the germination index of three wheat seeds under Cu stresses

冷等离子体处理对不同Cu浓度作用下苏麦188、宁麦15、苏麦128种子发芽指数的影响见图3。在相同等离子体处理条件下，随着Cu胁迫浓度的增加，小麦种子的发芽指数呈下降的趋势，在200 mg·L-1Cu胁迫下的宁麦15发芽指数较10 mg·L-1时Cu胁迫下降幅最大为12.5%。

种子经990 W冷等离子体处理后，相比对照处理，10 mg·L-1Cu处理下苏麦188和宁麦15的发芽指数有一定的提高，增幅分别为10.2%和10.3%；但是对中高浓度Cu胁迫下的小麦发芽指数几乎无影响。其他冷等离子体处理功率对不同Cu胁迫下3种小麦发芽指数的影响也不显著。整体而言，冷等离子体种子处理对Cu胁迫下的小麦发芽指数影响不显著。

2.2 冷等离子体处理对Cu胁迫下小麦根长、苗长的影响

冷等离子体处理对Cu胁迫下苏麦188、宁麦15和苏麦128根长、苗长的影响如图4所示。在对照处理中，Cu胁迫浓度越高，小麦根、苗生长受到的限制作用越明显，与10 mg·L-1Cu胁迫浓度的结果相比，高浓度200 mg·L-1Cu作用下小麦根长和苗长的降幅最大，分别为37.4%和54.8%。

冷等离子体处理对Cu胁迫下小麦的根长、苗长有显著的促进作用：当Cu胁迫浓度为10 mg·L-1时，与对照相比，500 W处理下宁麦15根长和苗长分别提高了46.2%和37.1%。当Cu胁迫浓度为50 mg·L-1时，同样，500 W的处理对苏麦188、宁麦15的根长和苗长都有明显的促进作用，其中苏麦188的根长和苗长分别增加了18.5%和4.7%，而宁麦15的根长和苗长分别增加了15.1%和75.5%；250 W处理下苏麦128的根长和苗长分别提高了19.3%和145.4%。当Cu胁迫浓度达200 mg·L-1时，不同功率的冷等离子体处理对3种小麦的根长和苗长的促进效果都很显著，其中250 W的处理对苏麦128的根长和苗长分别提高了15.1%和29.1%；500 W处理下苏麦188根长和苗长分别提高了20.0%和99.0%，宁麦15的根长和苗长也有19.2%和19.4%的提高。这表明适宜功率的冷等离子体处理对不同Cu胁迫浓度下的小麦幼苗生长均起到了明显的促进作用。

在相同的处理功率下，不同品种的小麦在Cu胁迫下的根长、苗长存在一定的差异。500 W的冷等离子体处理下苏麦188、宁麦15的根长和苗长均有显著提高，但对苏麦128的影响不显著。同样，250 W的冷等离子体处理下苏麦128的根长和苗长有明显提高，但对其他两个品种根长和苗长的影响不明显。说明不同品种的小麦适宜的冷等离子体功率不同。

2.3 冷等离子体处理对Cu胁迫下小麦活力指数的影响

图5为冷等离子体处理对Cu胁迫下苏麦188、宁麦15、苏麦128活力指数的影响。在对照处理下，Cu胁迫浓度越高，小麦的活力指数下降得越明显：50 mg·L-1Cu胁迫与10 mg·L-1Cu胁迫相比，苏麦188、宁麦15和苏麦128的活力指数分别下降了47.9%、46.4%和53.9%；而在200 mg·L-1Cu胁迫下，活力指数下降幅度更加明显，分别为69.5%、59.3%和66.6%。

图4 冷等离子处理对Cu胁迫下小麦种子根长、苗长的影响Figure 4 Effects of cold plasma treatment on roots and sprouts of wheat under Cu stresses

图5 冷等离子处理对Cu胁迫下小麦种子活力指数的影响Figure 5 Effects of cold plasma treatment on vigor index of wheat under Cu stresses

冷等离子体处理提高了不同Cu胁迫浓度下3种小麦种子的活力指数：当Cu浓度为10 mg·L-1时，与对照处理相比，500 W处理下宁麦15的活力指数提高了49.0%；当Cu胁迫浓度为50 mg·L-1时，500 W的处理使苏麦188、宁麦15的活力指数分别增加了12.4%和64.6%，而250 W处理下苏麦128的活力指数提高了82.1%；当Cu胁迫浓度达200 mg·L-1时，相比于对照处理，500 W的处理使苏麦188、宁麦15的活力指数分别增加了42.7%、19.4%，而250 W的处理使苏麦128的活力指数增加了38.0%。由此可见，适宜功率的冷等离子体处理能增强不同Cu胁迫浓度下小麦种子的活力指数。

在相同的处理功率下，不同品种的小麦在Cu胁迫下的活力指数存在一定的差异。500 W的冷等离子体处理对苏麦188、宁麦15的活力指数均有显著提高，但对苏麦128的影响不明显，甚至产生负作用。同样，250 W的冷等离子体处理对苏麦128的活力指数有显著提高，但对其他两个品种影响不明显。

2.4 冷等离子体处理对小麦幼苗根、苗Cu富集的影响

表1为冷等离子体处理对小麦幼苗根、苗中Cu富集特征的影响。从表1可以看出：无论是对照处理还是冷等离子体处理，随着Cu胁迫浓度增加，3种小麦幼苗根、苗中的Cu含量均有不同程度地升高，且Cu的富集系数均表现为根＞苗。同时，与对照处理相比，在Cu胁迫浓度为10 mg·L-1和50 mg·L-1时，冷等离子体处理整体上促进了根、苗对Cu的吸收，最高增幅分别达到了111.1%和26.3%；在Cu胁迫浓度为200 mg·L-1时，冷等离子体处理对Cu的吸收既有促进也有抑制，表现出不确定性；但是不同品种的小麦幼苗对Cu的转移系数却都呈现出升高的趋势，其中苏麦188和宁麦15的升幅较明显，而苏麦128的升幅不显著。由此可见，在低浓度Cu胁迫时，冷等离子体处理能够促进根和苗对Cu的吸收；在高浓度Cu胁迫时，冷等离子体处理在一定程度上提高了幼苗将根部的Cu转运到苗部的能力，从而减轻了Cu对根部的毒害作用。

表1 冷等离子体处理对小麦幼苗根、苗中Cu富集的影响Table 1 The effect of cold plasma treatment on the accumulation of copper in the root and seedling of wheat seeds

3 讨论

由于Cu是植物体内许多关键酶的辅基，是植物生长发育所必需的营养元素，因此，低剂量的Cu胁迫能够促进植物体内酶的合成，维持植物的正常新陈代谢[35]。但是，高浓度Cu胁迫对植物的生长发育有明显的抑制及毒害作用，例如抑制小麦的萌发、生长、细胞分裂与酶活性，进而影响小麦的光合作用和呼吸作用[36]。本研究也发现了类似的结果，即高浓度Cu存在时可明显抑制小麦种子的萌发与幼苗生长。而采用适宜功率冷等离子体处理虽然不能明显提高Cu胁迫作用下不同小麦种子的发芽率和发芽指数，但在一定程度上提高了小麦种子的活力指数，促进了小麦幼苗的生长，例如本研究结果呈现的小麦根长、苗长和活力指数较对照处理组的最大增幅分别为46.2%、145.4%和82.1%（图4和图5），这与报道的等离子体促进常规萌发条件下小麦种子萌发生长的结果类似[37-38]。据报道，冷等离子体处理可以提高种子中过氧化物酶、α-淀粉酶、琥珀酸脱氧酶等酶的活性，使种子呼吸作用增强，生物氧化过程加快，物质的合成与运输能力加速进行[39]，这可能也是本研究中冷等离子体处理增强小麦种子抗Cu胁迫作用的原因。

冷等离子体处理对种子萌发与作物生长影响的机制尚未完全清晰，Li等[40]从水分的吸收和酶活性等角度进行了探索。本研究从重金属吸收的角度对冷等离子体的作用机理进行了初步探索，在低浓度Cu作用时，冷等离子体在一定程度上能够促进根、苗对Cu的吸收，提高种子活力，Cu可参与到幼苗的生理生长过程中，对幼苗早期的生长发育起到了积极作用[41]；在高浓度Cu作用时，冷等离子体能够提高幼苗对Cu的转运能力，在一定程度上减轻了Cu对幼苗根部的毒害作用，从而促进了幼苗生长。

从不同功率冷等离子体处理的结果可以看出，不同小麦品种对冷等离子体的敏感性及耐受性存在明显差异。因此，该技术在今后实际应用时，需要根据作物品种确定适宜的冷等离子体功率。

4 结论

（1）随着Cu胁迫浓度的增加，未作冷等离子体处理的3种小麦种子的萌发和幼苗生长均表现出明显的抑制作用，冷等离子体种子处理可以有效缓解这种抑制作用。

（2）冷等离子处理对小麦在Cu胁迫作用下的发芽率、发芽指数影响不大，但是对根、苗的生长以及种子活力指数均有一定的提高。

（3）低浓度Cu胁迫下，冷等离子体能够促进幼苗对Cu的吸收，提高种子的活力；高浓度Cu胁迫时，冷等离子体处理能在一定程度上提高幼苗将根部的Cu转运到苗部的能力，减轻Cu对幼苗根部的毒害作用，从而促进幼苗的生长。