血清miR—21和miR—423—5p对心脏瓣膜病伴有心力衰竭患者的诊断价值

李玉梅　盛红彬　徐恒仕

[摘要] 目的 探讨血清miR-21和miR-423-5p对心脏瓣膜病（VHD）引起心力衰竭的潛在诊断价值。 方法 选择2014年8月～2016年4月上海交通大学医学院附属第九人民医院心内科收治的伴心力衰竭的VHD患者60例为VHD组，选择同期正常人60名为对照组。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测VHD伴有心力衰竭患者和正常人的血清miR-21和miR-423-5p表达，并利用ROC曲线分析miR-21和miR-423-5p作为VHD伴有心力衰竭诊断和预后生物标志物的临床价值。 结果 VHD组患者血清miR-21和miR-423-5p表达明显高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。伴有肺动脉高压（PH）的VHD患者血清miR-423-5p水平高于PH的VHD患者，差异有统计学意义（P < 0.05）。ROC曲线结果显示，血清miR-21和miR-423-5p可以作为VHD伴心力衰竭的诊断标志物。 结论 血清miR-21和miR-423-5p具备诊断VHD伴有心力衰竭的临床价值。血清miR-423-5p可作为VHD伴有心力衰竭的诊断标志物。

[关键词] miRNA；miR-423-5p；心瓣膜病；心力衰竭；肺动脉高压；ROC曲线

[中图分类号] R541.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）11（c）-0151-05

Diagnostic values of miR-21 and miR-423-5p in patients with valvular heart disease and heart failure

LI Yumei1 SHENG Hongbin2 XU Hengshi1

1.Department of Blood Transfusion， Shanghai Ninth People′s Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 201999， China； 2.Department of Clinical Pharmacy， Shanghai Ninth People′s Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 201999， China

[Abstract] Objective To investigate the potential diagnostic value of serum miR-21 and miR-423-5p for heart failure （HF） due to heart valve disease （VHD）. Methods From August 2014 to April 2016， in Shanghai Ninth People′s Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， 60 VHD patients with HF were selected as VHD group， at the same period， 60 healthy persons were selected as control group. The levels of serum miR-21 and miR-423-5p were measured by qRT-PCR. The ROC curve was used analyse the clinical Value of miR-21 and miR-423-5p as VHD with biomarkers for diagnosis and prognosis of heart failure. Results The levels of miR-21 and miR-423-5p in sera of patients in VHD group were higher than control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The levels of miR-423-5p in sera of VHD patients with pulmonary hypertension （PH） were higher than VHD patients without PH， the differences were statistically significant （P < 0.05）. ROC curve result showed that serum miR-21 and miR-423-5p had potential diagnostic values on HF due to VHD. Conclusion Serum miR-21 and miR-423-5p show potential diagnostic values on HF due to VHD. Moreover， serum miR-423-5p can be an effective biomarker for diagnosing VHD patients with PH.

[Key words] MiRNA； MiR-423-5p； Valvular heart disease； Heart failure； Pulmonary hypertension； ROC curve

心力衰竭已成为全球重大健康问题，发病率正逐年增加[1]。为了诊断心力衰竭，临床上发现诸多生物标志物。其中B型脑钠肽（BNP）和氨基末端脑钠肽前体（NT-ProBNP）曾被认为是诊断心力衰竭的良好生物标志物[2]。但亦有报道，在严重的心脏收缩降低情况下，BNP并不足以衡量心脏阻塞程度[3]。因此急需更有效的非损伤性心力衰竭诊断标志物。

miRNA是一类长度为21～23个核苷酸的非编码RNA分子，其在心肌梗死、心力衰竭等心脏疾病中有重要作用[4]。报道显示miRNA的异常表达可能与心脏类疾病相关，可能成为诊断心力衰竭的有效标志物[5]。miRNA曾被当作是诊断心力衰竭的循环生物标志物[6]。研究表明，miR-21在患有由心脏瓣膜病（VHD）导致的心力衰竭的犬中呈现减量调节趋势[7]。此外，心力衰竭患者中miR-423-5p的表达有所增加，意味着miR-423-5p有可能是一种诊断心力衰竭的有效标志物[8]。本研究旨在通过临床验证，预测miR-423-5p表达与患有心力衰竭的VHD相关性，进而证实miR-423-5p和miR-21在由VHD导致的心力衰竭中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年8月～2016年4月上海交通大学医学院附属第九人民医院心内科收治的VHD伴心力衰竭的患者60例为VHD组，对年龄超过50岁且可能患有冠状动脉疾病的患者进了血管造影术。纳入标准：①年龄超过18周岁；②通过体检确保患有VHD；③具备纽约心脏协会心力衰竭诊断标准症状[9]。排除标准：①有心肌衰弱或者正患有心力衰竭的患者，通过血管造影术发现动脉血管阻塞区域超过75%的患者，接受过支架移植术的患者；②有肺部疾病的患者；③有甲状腺功能亢进和慢性贫血的患者；④有高血压的患者。根据世界卫生组织最新分类，被诊断出患有肺动脉高压（PH）的患者[10]，入选标准为平均肺动脉压（mPAP）≥25 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），肺部输入压≤15 mmHg。选择同期正常人60名为对照组。本次研究对象已经排除肿瘤等混杂因素的影响。每位参与者抽取5 mL血液样本，立即离心提取血清，并将其保存于-80℃冰箱。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有患者或家属均知情同意。

1.2 RNA的抽取和逆转录聚合酶链式反应

按照程序，RNA通过使用mir VanaTM PARIS miRNA isolation kit（美国，Ambion）进行分离。总RNA通过TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒（美国，Applied Biosystems）进行逆转录。qRT-PCR反应使用了SYBR Premix Ex Taq试剂盒（中国，TaKaRa）在ABI PRISM 7900HT测序系统上进行的。qRT-PCR反应体系详见表1，扩增条件设置为95℃ 15 min；95℃ 10 s；60℃ 30 s；循环40次。2-△△Ct循环阈值法来计算目标miRNA的相对表述水平[11]。

1.3 统计学方法

采用统计学软件SPSS 21.0对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。绘制ROC曲线，利用AUC面积来评价血清miRNA水平的诊断价值。Pearson相关分析检验相关性。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料比较

两组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。但VHD组的NT-proBNP和HsCRP水平明显高于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01），两组LVEDd和LVEF比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.2 血清miR-21和miR-423在VHD患者中的过表达

VHD组患者的血清miR-21表达水平（1.69±0.72）明显高于对照组（1.04±0.59），差异有统计学意义（P < 0.05）；同时VHD组患者的血清miR-423-5p的表达水平（0.93±0.41）也明显高于对照组（0.16±0.07），差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.3 VHD组患者HsCRP水平与血清miR-21和miR-423-5p表达水平的相关性

Pearson相关分析显示，VHD组患者的血清miR-21和miR-423-5p的表达水平与超敏C反应蛋白呈正相关（r = 0.619、0.646，P = 0.004、0.002）。此外VHD组患者中血清miR-21的水平与miR-423-5p呈正相关（r = 0.569，P = 0.009）。见图2。

2.4 血清miR-21与血清miR-423-5p在 VHD伴有心力衰竭中的诊断价值

血清miR-21、miR-423-5p和NT-proBNP的ROC曲线详图3。其中血清miR-21的AUC值为0.772，提示其对VHD伴有心力衰竭有一定的诊断作用。另外，血清miR-423-5p的AUC值为0.965，比NT-proBNP高（AUC值为0.900），提示血清miR-423-5p也可作为VHD伴有心力衰竭的诊断标志物。

2.5 血清miR-423-5p对伴有PH的VHD患者的诊断价值

本研究将VHD患者分不伴有PH和伴有PH兩组，发现伴有PH患者的血清miR-423-5p水平较高于不伴有PH患者，差异有统计学意义（P < 0.05），而两组血清miR-21和NT-proBNP水平差异无统计学意义（P > 0.05），见表3。ROC曲线结果提示，伴有PH的VHD患者的血清miR-423-5p AUC值为0.805（图4），说明血清miR-423-5p可能用于诊断VHD患者是否伴有PH。

3 讨论

研究证实miRNA可通过与其他媒介反应来避免被RNA酶降解，并稳定存在于血浆、尿液、眼泪等细胞外液中[12]。相比从组织样本中提取，循环miRNA更易获取，可反复测量[13]。有报道称循环miRNA是诊疗多种心脏疾病的重要生物标志物[14]。而循环miRNA在伴有VHD的心力衰竭中的诊断价值却少有研究。

miR-21可以通过调节Bcl-2来促进心脏纤维变性，这会导致心力衰竭的恶化[15]。有研究显示，为了加强心脏血管生成过程中的细胞迁移，miR-21会抑制PDCD4的表达，这意味着miR-21和VHD存在一定联系[16]。在本研究中，VHD组血清miR-21的表达水平明显高于对照组（P < 0.05）。这就表明血清miR-21可能对VHD患者中的心力衰竭有潜在诊断价值，联合血清miR-423-5p有更高诊断意义。

由于miR-423-5p主要存在于心包积液中，与其它的循环miRNA如miR-133a相比，miR-423-5p的表达模式有明显不同，说明miR-423-5p可能作为VHD伴有心力衰竭的生物标志物[17]。本研究显示，血清miR-423-5p在VHD组中的表达明显高于对照组，且血清miR-423-5p水平与VHD患者的PH相关。由于本研究已排除原发性的肺部疾病，表明PH是由VHD引起。严重的慢性心力衰竭是导致PH的常见原因，并且伴有PH的舒张期心力衰竭发病率要高于收缩期心力衰竭[18-19]。该研究中，在对伴有PH的VHD的诊断中，血清miR-423-5p的敏感性要高于NT-proBNP。因此，在评估伴有心力衰竭的VHD时，血清miR-423-5p可以作為一种有效的预测生物标志物。

近年研究已证明，miR-21能刺激NF-kB（核内转录因子）或PDCD4，并调控心肌细胞的凋亡[20]。而miR-423-5p在诱发心脏病方面的作用与miR-21和miR-423-5p在循环水平的联系还需要进一步研究。最后，本研究发现血清miR-21和miR-423-5p可作为潜在并有独立性的生物标志物来对VHD伴有心力衰竭患者进行诊断。血清miR-423-5p在评估伴有心力衰竭的VHD患者的严重程度上有较高的敏感性，并且对伴有PH的VHD患者也有较好的诊断价值。

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（收稿日期：2017-11-21 本文編辑：苏 畅）