阴炎净洗液对大鼠接触性皮炎湿疹的抗炎作用及其分子机制研究

谭谦　欧阳波　肖作奇

[摘要] 目的 探究陰炎净洗液对大鼠接触性皮炎湿疹（ACD）的抗炎作用及其分子机制。 方法 将50只雌雄各半的SPF级SD大鼠按随机数字表法分为五组，分别为空白对照组（纯化水50 μL）、ACD模型组（纯化水50 μL）、阳性对照组（地塞米松磷酸钠注射液50 μL）、低剂量治疗组（阴炎净洗液50 μL）和高剂量治疗组（2倍浓缩阴炎净洗液50 μL），每组10只，每天相应药物涂抹右耳2次，给药10 d。观察皮肤变应性反应和肿胀度，利用免疫组织化学法和蛋白免疫印迹实验检测磷酸化细胞外调节蛋白激酶（pERK1/2）和核因子κB（NF-κB）的表达水平。 结果 与空白对照组比较，ACD模型组大鼠耳肿胀度明显升高（P < 0.01）。与ACD模型组比较，高剂量治疗组和低剂量治疗组的耳肿胀度均明显降低（P < 0.01）。与空白对照组比较，ACD模型组大鼠耳组织中pERK1/2和NF-κB的蛋白表达明显升高（P < 0.01）。与ACD模型组比较，高剂量治疗组和低剂量治疗组的pERK1/2和NF-κB的蛋白表达均明显降低（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 阴炎净洗液对ACD大鼠有抗炎作用，其机制可能是依赖于对pERK1/2/NF-κB信号通路的抑制作用。

[关键词] 阴炎净；接触性皮炎；核因子κB通路；pERK1/2

[中图分类号] R758.22 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）11（c）-0013-04

Study of anti-inflammatory effect and molecular mechanism of Yinyanjing Lotion

TAN Qian OUYANG Bo XIAO Zuoqi

Department of Pharmaceutical Preparation， Hu′nan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital， Hu′nan Province， Changsha 410008， China

[Abstract] Objective To investigate anti-inflammatory effect and molecular mechanism of Yinyanjing Lotion on allergic contact dermatitis （ACD） rats. Methods Fifty half male and half female SPF grade SD rats were randomly divided into 5 groups according to random number table method， including blank control group （purified water 50 μL）， ACD model group （purified water 50 μL）， positive control group （Dexamethasone Sodium Phosphate Injection 50 μL）， low dose treatment group （Yinyanjing Lotion 50 μL） and high dose treatment group （2 times concentrated Yinyanjing Lotion 50 μL）， with 10 rats in each group. The right ears were smeared with drugs twice a day for 10 days. The allergic reaction and swelling degree of the skin were observed， and the expression levels of phosphorylated extracellular regulated protein kinases （pERK1/2） and nuclear factor κB （NF-κB） were detected by immunohistochemistry and Western blot. Results Compared with the blank control group， the ear swelling degree of rats in the ACD model group was significantly increased （P < 0.01）. Compared with the ACD model group， the ear swelling degree of rats in the high dose treatment group and low dose treatment group was significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the blank control group， the protein expression of pERK1/2 and NF-κB in the ACD model group was significantly up-regulated （P < 0.01）. Compared with the ACD model group， the protein expression of pERK1/2 and NF-κB in the high dose treatment group and low dose treatment group was significantly down-regulated （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Yinyanjing Lotion has an anti-inflammatory effect on ACD rats， and the mechanism may be achieved by inhibition of pERK1/2/NF-κB signaling pathway.

[Key words] Yinyanjing； Allergic contact dermatitis； Nuclear factor-κB pathway； pERK1/2

阴炎净洗液（以下简称“阴炎净”）作为湖南省妇幼保健院（以下简称“我院”）的医疗制剂被广泛用于阴道炎、盆腔炎等妇科炎症的预防和治疗，近年来该制剂也在儿科用于湿疹、皮炎等皮肤炎症的治疗[1]。基于对阴炎净在接触性皮炎湿疹（ACD）治疗过程中的前期研究，我们发现对于2，4-二硝基氯苯（DNCB）诱发的ACD大鼠[2]，阴炎净有显著的治疗作用，经过阴炎净治疗的大鼠背部皮肤的肿胀度明显降低，且研究结果表明阴炎净的抗炎活性强度与有效成分的浓度呈正相关[3]。对阴炎净抗炎机制的探究，已经初步确定该制剂能引起ACD大鼠血清中的白细胞介素（IL）-2、IL-4和γ干扰素（IFN-γ）浓度显著降低，但是引起这一生理变化的分子机制尚不明确。而在许多的炎症动物实验研究中报道了NF-κB的信号通路在炎性反应和自身免疫反应中的调节作用[4]。例如在邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）诱导的ACD小鼠上，NF-κB信号通路被激活，从而加重了炎性反应[5]。核因子κB（NF-κB）的激活被认为是引起细胞应激反应的一部分，继而将生成不同的激活链，包括各种细胞因子的释放以及通道蛋白的激活[6-7]。而磷酸化细胞外调节蛋白激酶（pERK1/2）作为细胞内调节蛋白酶可能是NF-κB激活的信号传递者。因此，本研究旨在探究NF-κB信号通路激活在阴炎净抗炎活性中的调节作用，并假设pERK1/2/NF-κB是关键的分子基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究采用体重为50～60 g的SPF级SD大鼠50只，雌雄各半，购自湖北省疾病预防控制中心，动物合格证号为42000600022106。每组动物分笼饲养，自由摄食。所有动物实验均于中南民族大学实验动物中心（SPF级）进行并严格根据中南民族大学动物实验委员会制订的实验动物操作标准进行操作。

1.2 药物与试剂

阴炎净洗液（我院院内制剂，规格：250 mL，批号：20170503）；地塞米松磷酸钠注射液（安微金太阳药业，规格：5 mg/mL，批号：170712011）；DNCB（山东西亚化学股份有限公司，批號：W5656）；免疫组化试剂盒（三心达生物科技有限公司，货号：1632）；Anti-NF-κB（p65）（货号：GB11142）、Anti-pERK1/2（货号：GB11510）、Anti-β-Actin（货号：GB11001）、蛋白定量检测试剂盒（货号：G102）和SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（货号：G2003）均购于武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.3 仪器设备

Leica RM2235型莱卡石蜡切片机（德国莱卡）；DP72奥林巴斯显微成像系统（OLYMPUS）；D-37520高速离心机（Thermo Fisher Scientific，离心半径60 mm）；CP114电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；凝胶成像系统（Thermo Fisher Scientific）。

1.4 ACD动物模型制备

采用DNCB诱导大鼠ACD模型：将DNCB溶解在混合溶剂（丙酮/橄榄油，4∶1，V/V）中，配制成7%和1%的DNCB溶液。用硫化钠彻底去除大鼠腹部2 cm2的毛发。第1天用7% DNCB溶液50 μL涂抹于除毛的腹部致敏，第2天用1% DNCB溶液50 μL增强致敏。第5天开始，每日将1% DNCB溶液20 μL涂抹于大鼠右耳，连续3 d，即制得DNCB诱发的ACD大鼠模型[8]，选取造模成功大鼠40只。

1.5 分组与给药

取10只正常大鼠作为空白对照组；取40只ACD大鼠进行编号，然后按随机数字表法将其分为ACD模型组、阳性对照组、高剂量治疗组、低剂量治疗组，每组10只。空白对照组：纯化水50 μL；ACD模型组：纯化水50 μL；阳性对照组：地塞米松磷酸钠注射液50 μL；高剂量治疗组：2倍的阴炎净液浓缩液（取约100 mL药液，60℃减压浓缩干至体积减半）50 μL；低剂量治疗组：原倍阴炎净50 μL。每天在右耳外侧涂抹给药2次，早晚8：00各1次，连续10 d。

1.6 皮肤变应性反应评估

经过药物治疗10 d，根据湿疹面积和严重程度评估右侧耳组织变应性反应。通过6 mm打孔器取耳组织块进行计重和耳厚度测量来评估耳肿胀度。同时各组取3只大鼠的样本用4% PFA固定，石蜡包埋切片（4 μm），HE染色[9]，根据单核细胞浸润、表皮角化程度进行评估。

1.7 免疫组织化学分析

检测大鼠耳组织中的pERK1/2和总NF-κB（p65）的蛋白表达水平。取3只大鼠的右耳石蜡切片，应用经典石蜡切片的免疫组织化学方法[10]进行操作，即经过脱蜡、固定后，按试剂盒操作步骤加入一抗（1∶500稀释）、二抗，然后染色并封片。用Image-Pro Plus 6.0软件分析各样本的平均光密度（IOD）值，其中统计数据表现为各组样本的平均IOD值与空白对照组的平均IOD值的比值。

1.8 蛋白免疫印迹实验

检测大鼠耳组织中的pERK1/2和总NF-κB（p65）的蛋白表达水平。每组取6只大鼠组织样本，每次实验采用2只大鼠的样本进行混合，进行3次重复实验。依据常规的免疫蛋白的实验方法，首先将样本用PBS清洗。在冰浴条件下完全裂解组织得到匀浆液，离心后取上清液。制得的蛋白样本经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，然后转膜。免疫反应过程：经过封闭1 h后，一抗（1∶200稀释）孵育过夜，洗脱后二抗孵育[11]。经分子凝胶成像系统成像后用Alpha软件处理系统分析目标条带的灰度值。

1.9 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计量资料以均值±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett′s t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠大鼠耳变应性反应比较

经过10 d的药物处置，ACD模型组大鼠右耳仍呈现明显的红肿、结痂，而阳性对照组治疗后基本恢复到正常耳朵的样子，偶见一些耳静脉充血，高剂量治疗组的耳朵恢复与阳性对照组类似，低剂量治疗组大鼠的耳朵可见轻微红肿，见图1（封三）。与空白对照组比较，ACD模型组大鼠耳厚度和耳重量明显增加，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与ACD模型组比较，高剂量治疗组和低剂量治疗组的耳厚度和耳重量均明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.2 各组大鼠右耳组织病理学变化比较

与空白对照组比较，ACD模型组大鼠右耳出现明显的单核细胞浸润和表皮细胞角化，并且在切片中也可见ACD模型组大鼠耳朵有显著的肿胀，并且这些单核细胞浸润和表皮细胞角化现象在阳性对照组、低剂量治疗组、高剂量治疗组中都有显著的改善。见图2。

2.3 各组大鼠pERK1/2表达水平比较

免疫组化和蛋白免疫印迹的结果均显示：与空白对照组比较，ACD模型组pERK1/2的蛋白表達水平显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与ACD模型组比较，高剂量治疗组和低剂量治疗组的pERK1/2蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3（封四）。

2.4 各组大鼠NF-κB（p65）表达水平比较

免疫组化和蛋白免疫印迹的结果均显示：与空白对照组比较，ACD模型组NF-κB的蛋白表达水平显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与ACD模型组比较，高剂量治疗组和低剂量治疗组的NF-κB的蛋白表达水平均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图4（封四）。

3 讨论

NF-κB是一种核转录因子，它调节大量基因的表达，这些基因对细胞凋亡、炎症和各种自身免疫性疾病的调节至关重要。NF-κB的活化被认为是应激反应的一部分，因为它被多种刺激物激活，包括生长因子、细胞因子、淋巴因子和药理学药物[12-15]。而NF-κB系统的研究大多集中于NF-κB信号通路激活后对细胞分泌IL-1[16-19]和TNF-α[20-23]的影响，而药物作用于机体后如何进一步激活NF-κB尚不明确，膜受体蛋白类如Toll蛋白家族被认为是参与活化的关键分子[24-26]。本研究中DNCB诱导的ACD大鼠体内同样测得NF-κB蛋白表达量显著增加。为了进一步探究ACD类型的炎性反应的信号通路，本研究着重通过检测与NF-κB相关的信号蛋白分子pERK1/2的表达水平的变化来阐明炎症信号的传递[27-30]。pERK1/2是细胞内信号传递的重要信使，结合本研究中免疫组化和蛋白免疫印迹结果分析，ERK在与半抗原DNCB细胞表面接触后迅速磷酸化。这一过程可能加速了NF-κB系统的信号转导，最终诱发了严重的炎性反应[31]。而本研究的治疗药物阴炎净经过10 d的给药期，使ACD大鼠体内的pERK1/2和NF-κB蛋白表达水平显著降低。提示阴炎净对pERK1/2/NF-κB信号通路有显著的抑制作用，且这种抑制作用在ACD大鼠中表现为抗炎的药理活性。

本研究结果提示，阴炎净对DNCB诱导的ACD大鼠耳变应性反应有显著的改善作用，并且经过10 d的治疗周期后，阴炎净可通过抑制ERK的磷酸化来抑制NF-κB信号通路。由此我们可进一步判断阴炎净在ACD大鼠中发挥抗炎活性的分子机制可能是依赖于对pERK1/2/NF-κB信号通路的抑制作用。

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（收稿日期：2018-07-17 本文編辑：罗乔荔）