蒽环类药物诱导MDM2剪接体表达的相关研究

周锋 褚雪峰 史发兰

【摘要】 目的 探讨DNA损伤蒽环类药物诱导MDM2产生剪切体的表达。方法 采用多种DNA损伤药物处理原代胚胎成纤维细胞后， 分别利用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-Time PCR）和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测MDM2的剪接体表达， 进一步通过测序分析剪切体的序列。结果 蒽环类药物可以诱导MDM2的第10号和第11号外显子中间插入108 bp的片段， 并且该片段中含有终止密码子， 促使丢失第11号和第12号外显子。羟基脲（Hu）和5-氟尿嘧啶（5-Fu）并不能诱导MDM2剪接体的产生。结论 蒽环类药物可以诱导MDM2剪切体的表达。

【关键词】 蒽环类药物；MDM2；剪接体实时荧光定量聚合酶链式反应

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.35.113

【Abstract】 Objective To discuss the expression of DNA damage anthracyclines induced MDM2 spliceosome. Methods After treatment of primary embryonic fibroblasts with various DNA-damaging drugs， the expression of splicesome of MDM2 was detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （Real-Time PCR） and reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）， respectively， and the sequence of the splicing was further analyzed by sequencing. Results Anthracyclines can induce the insertion of 108 bp fragment between exons 10 and 11 of MDM2， and the fragment contains termination codon， which leads to the loss of exons 11 and 12. hydroxyurea （Hu） and 5-fluorouracil （Fu） could not induce the production of MDM2 splice. Conclusion Anthracyclines can induce the expression of MDM2 spliceosome.

【Key words】 Anthracyclines； MDM2； Spliceosome

MDM2是一个含有双微体的蛋白， 在细胞内主要作用参与调控真核细胞的生长、程序化死亡和DNA损伤的修复等[1-4]。MDM2位于人类染色体12q13-14上， 由12个外显子编码491个氨基酸[5]。MDM2的表达在人体正常多个组织和器官中， 骨骼肌中表达最高， 其次为肝、肺等， 与细胞的基本生理活动有关[6， 7]。此外， 在人类许多肿瘤中， 如肺癌、乳腺癌及结肠癌中， 都可以检测到MDM2基因的扩增表达[8-10]。MDM2具有多种功能， 研究最广泛的是其具有E3泛素连接酶活性[11， 12]。在癌症中其主要功能是降解抑癌基因P53， 促进肿瘤的形成[13]。但是突变或者过表达的P53也可以负反馈调节抑制MDM2的表达， 使其在癌症中失去功能。MDM2主要的功能区域分成2个。第一个重要结构域是1～241位氨基酸， 主要功能是结合P53， 使P53调控细胞周期G1期的功能丧失同时调控细胞凋亡的功能失去。这个区域同时还可以结合P73和E2F1蛋白。第二个重要的结构域是242～331位氨基酸， 其中包含了C4种类的锌指结构域， 具有重要的E3泛素化P53蛋白的能力[14]。另外MDM2含有一个核定位信号序列（NLS）， 包括核输出信号（NES）和核定位信号（NoLS）[15]。 目前已知的MDM2转录由两个启动子控制， 可以产生不同的转录本。这两个启动子最大的区别在于是否依赖于P53。第一个启动子无P53的结合位点， 第二个启动子区域中含有2个P53结合位点， 结合时可以激活MDM2的转录。研究還发现MDM2基因启动子区域存在一个单核苷酸多态性（SNP）位点（SNP309）， SNP309位点突变时（T-G）， 会增强转录因子SP1与MDM2的结合增强， 进而上调MDM2的转录水平和蛋白水平， 促进肿瘤的形成。还有研究发现， PTEN可以通过P1启动子调节MDM2的mRNA水平[16]。迄今为止， 已经发现了在不同癌症中MDM2有多达72种选择性剪切[17， 18]。但是这些选择性剪切产物的形成和诱因并不清楚。

蒽环类药物是一类抗肿瘤效果非常显著的药物， 无论在血液肿瘤或者实体肿瘤中都具有很好的治疗效果， 在癌症的治疗中具有极其重要的地位。目前， 常见的蒽环类药物主要有阿霉素（Dox）、表阿霉素、柔红霉素和伊比达星等[19]。蒽环类药物作用于肿瘤的机制大多以DNA为作用靶点， 利用平面的稠环芳香结构嵌入到DNA的双螺旋结构中， DNA聚合酶和核酸的合成过程受阻， 导致DNA双链结构破坏， 阻碍了癌细胞的增殖， 最终发挥抗肿瘤的作用。

本研究发现DNA损伤药物Dox及蒽环类药物均可以诱导MDM2剪切体的表达， 插入的剪切体可终止密码子， 阻断MDM2的转录， 使其失去了部分功能， 这一研究阐明了DNA损伤药物蒽环类化疗药诱导MDM2剪切体表达的分子机制。为蒽环类药物在肿瘤治疗中的应用提供了理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 实验细胞：实验用原代胚胎成纤维细胞（MEFs）取自怀孕13.5 d小鼠， 由实验室自行制备。实验试剂：HDMEM（高糖）培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）购于美国Gibco公司。Realtime-PCR使用的SYBR购于日本TAKARA公司。RNA提取试剂TRIZOL试剂购自赛默飞公司。实验用限制性内切酶、T4连接酶均购于NEB公司。实验所用的Dox、表阿霉素、柔红霉素、伊比达星、Hu和5-Fu均购自Sigma公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 MEFs细胞制备与培养 首先将怀孕13.5 d的母鼠麻醉， 利用CO2处理母鼠致死后， 剪開腹壁暴露出子宫角。随后取出胚胎将其转移到含有PBS的培养皿中， 洗3遍。洗完后， 用眼科剪刀将组织剪碎， 大约碎块1 mm3。吸出转移到15 ml离心管中， 加入2 ml胰蛋白酶/EDTA在37℃细胞培养箱中孵育大约20 min。用10 ml培养基（含10%FBS）终止胰蛋白酶/EDTA的消化， 1500 rpm离心后转移至培养皿内。37℃培养过夜， 当培养瓶中的细胞长到80%～90%汇合时并仍处于指数生长期时， 可以进行实验。

1. 2. 2 蒽环类药物处理MEFs细胞 将MEFs细胞种6孔板后， 每孔1×106细胞， 分别利用10 ?M的阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、伊比达星和2 μl DMSO处理MEFs细胞， 作用24 h后提取RNA。

1. 2. 3 实时定量PCR检测目的基因mRNA水平 采用TRIZOL法提取总RNA， 利用紫外分光光度计NANO Drop3000检测RNA的纯度及浓度。提取2 μg RNA利用cDNA第1条链反转录试剂盒制备cDNA， 成功后进行实时荧光定量PCR反应检测。使用7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）， 按照Invitrogen PCR操作手册进行Real-Time PCR。

PCR反应条件：95℃ 5 min预变性， 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s共进行40个循环， 以2-△△CT值评估相对表达量。每组实验设置3个复孔。所用实验重复3次。在NCBI网站查取MDM2的基因序列NM_010786， 为了防止基因组DNA污染， 跨外显子设计。

1. 3 统计学方法 用2-△△ct法处理实时荧光定量RT-PCR所得的CT数据， 采用SPSS 15.0软件处理获得的数据， 由于实验组标本2-△△ct值不符合正态分布， 以2个独立样本检验进行统计分析；计量资料采用t检验， 计数资料采用χ2检验， P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 Dox诱导MEFs细胞出现MDM2的剪切体 利用诱导DNA损伤药物Dox（Doxorubicin）处理MEFs细胞后， 提取RNA， 反转录成cDNA进行PCR检测MDM2的表达。根据MDM2的序列， 在跨第10号和第11号外显子设计引物， 目的片段长度150 bp， 见图1。结果显示， 在对照组（DMSO）检测到了目的片段150 bp， 在Dox诱导组不仅检测到了150 bp目的片段， 另外还检测到了一条250 bp左右的片段。综合以上结果， 准备对Dox处理MEFs细胞后MDM2剪切体250 bp片段进行下一步研究， 见图2。

2. 2 Dox诱导MDM2剪切体的研究 利用诱导DNA损伤药物Dox处理MEFs细胞后， 扩增MDM2后将250 bp片段切胶回收， 克隆到T载体后进行测序， 测序结果比对后发现在第10号和第11号外显子之间插入了一段108 bp片段， 并且这段序列中有终止密码子TGA。进一步根据这段序列设计Real time-PCR引物， 证实了Dox可以诱导MDM2的剪切体。见图3。

2. 3 Hu和5-Fu不可以诱导MDM2的剪切体表达 诱导DNA损伤的药物有很多种， 比如Hu、5-Fu等， 分别利用Hu和5-Fu处理MEFs细胞后， 进行PCR的检测， 结果发现只有Dox可以诱导MDM2的剪切体表达， 差异有统计学意义（P<0.05）。见图4， 图5。

2. 4 蒽环类药物均可以诱导MDM2的剪切体表达 蒽环类药物主要包括Dox、表阿霉素、柔红霉素和伊比达星等（见图6）。为了探索MDM2剪切体的表达， 分别用这4种药物处理MEFs细胞后， 进行PCR扩增检测。结果显示， 这4种药物均可以诱导MDM2剪切体的表达， 差异有统计学意义（P<0.05）。见图7， 见图8。

3 讨论

P53是一个DNA损伤应激蛋白， 可以参与调控细胞的凋亡， 细胞周期阻滞和细胞衰老[20， 21]。MDM2是P53的主要负调控基因， 通过泛素化降解P53[22]。目前， 很多研究发现MDM2的功能与它本身mRNA的选择性剪切与肿瘤的发生和发展密切相关。在多种癌症中都发现了MDM2存在不同的剪切体， 然而它的功能和发生原因还不清楚。本研究中发现了DNA损伤时可以诱导MDM2的选择性剪接， 但是只有蒽环类的药物可以诱导MDM2剪切体表达， 而其他化疗药物比如Hu和5-Fu并不能引起MDM2的选择性剪切。蒽环类药物主要包括Dox、表阿霉素、柔红霉素和伊比沙星等广泛地用于治疗血液病和实体肿瘤， 比如急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌和结肠癌等[23]。蒽环类药物优点是具有抗瘤广谱性， 抗瘤能力强， 疗效好。但是引起的不良反应较严重， 主要是脱发和心脏毒性[24]。其作用机理主要是通过嵌入DNA双链的碱基之间， 形成稳定复合物， 抑制DNA复制与RNA合成， 从而阻碍快速生长的癌细胞的分裂[25]。Hu[26]和5-Fu[27]的作用机理不同于蒽环类药物， 在体内主要是引起DNA的单链断裂， 影响DNA和RNA的生物合成， 抑制肿瘤细胞的增殖。这也许解释了为何只有蒽环类药物可以诱导MDM2的选择性剪切， 接下来会深入研究具体的原因。

本研究首次發现了MDM2的RNA新的剪切体， 通过测序解析了插入序列， 在10号外显子后插入了终止密码子， 阻断了MDM2的转录及其蛋白质的合成。MDM2的11号和12号外显子编码的蛋白是E3泛素连接酶结构域， 当MDM2失去E3泛素连接酶活性时， 就不能够降解P53， 丢失了对P53的调控作用。本研究能够更好的理解MDM2-P53通路复杂的调节机制， 并对靶向MDM2的化疗药物的开发具有重要的影响。

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[收稿日期：2018-06-29]