基于酶底物法对菌落总数不确定度的评估分析

赵 鑫

(辽宁省鞍山水文局，辽宁 鞍山 114001)

在我国东北地区，尤其是偏远的农村，地下水仍然是居民的主要饮用水来源。在对饮用水水质进行卫生学及污染程度评价时，菌落总数是重要指标之一。目前，菌落总数的测定方法主要采用平皿计数法[1]、测试片法[2]、多管发酵法等。上述方法所用设备简单，但操作过程比较繁琐，不适用于应急检测。酶底物法则操作简便、结果判读快速准确、1mL水样无需稀释即可检测出738个菌落总数。

测量结果质量的评定需要引入不确定度参数，任何检测措施都存在一定的不确定度，因而此参数是实验室质量管理体系的重要组成部分[3]，是提供准确测量结果的保障。水质微生物指标是实验室质量控制的组成部分之一，目前大部分不确定度评定多用在理化实验中，而微生物由于其特殊性，此方面研究较少，本文针对海城地下水具体实例，进行菌落总数不确定度评定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

PYL- 45电热恒温培养箱，1、10mL移液枪，366nm紫外灯、Simplate 84孔分配盘、培养基均由美国IDEXX公司提供。实验用水为电阻率18.25MΩ·cm的超纯水。

1.2 原理与方法

酶底物法所用的培养基中含有多种不同的酶物质，每一种酶的设计都有相应的细菌与之对应。细菌的特异性代谢产物会与培养基中的酶反应产生荧光信号，可用366nm紫外灯观察。

用100mL超纯水溶解固体培养基，摇匀后使用，取1mL水样和9mL淡黄色液体培养基于分配盘中央，盖好盖子，在桌面上水平移动使混合液平均分配到每个孔中。将分配盘倾斜45°使多余溶液被海绵条吸收，分配盘在35±5℃下倒置培养48h。取出分配盘打开盖子放置于13cm高处的紫外线灯下，数出显荧光的孔格(海绵条不计入内)，对照专用MPN表得出菌落总数，如图1所示。

图1 酶底物法检测菌落总数方法

1.3 不确定度来源

不确定度是表征合理地赋予被测量值的分散性，与测量结果相联系的参数[4]。不确定度的来源有很多[5]，在微生物检测中主要来源于实验室环境变化，实验人员操作差异，培养温度、时间、培养基批次的不同，以及样品保存的方法和条件的不同等。

1.4 数学模型及方法

A=x

(1)

式中，A—菌落总数，CFU/mL；x—实验检测结果，CFU/mL。

由于细菌分布不均匀导致检测结果分散，对菌落总数取对数后可使数据接近正态分布，再选取贝塞尔法评定其不确定度。

2 结果与讨论

2.1 合成标准不确定度

以海城地下水为例，由同一名检测员按照酶底物法，在同样的实验条件下，重复实验15次，得到菌落总数测试结果，见表1。

表1 海城地下水菌落总数结果 单位：CFU/mL

根据贝塞尔公式，首先计算每组实验数据的合并样本标准偏差：

(2)

则合成标准不确定度：

(3)

2.2 扩展不确定度

本次实验中，自由度v=15，选取95%置信水平，查t分布表得包含因子k95(15)=2.13，则扩展不确定度U95=2.13×0.015=0.032，即lgx=2.4984±0.032=2.4664～2.5304。取反对数，得海城地下水菌落总数取值区间为293～339CFU/mL。

3 结论

酶底物法检测菌落总数时，是按照MPN表读取孔格数对应的菌落总数值，得到的检测结果有时会相差较大，所以对实验结果取对数通过合并样本标准偏差的方法来评估不确定度更加准确。

分析实验结果，可以看出微生物检测时数据结果分散性较大，以A类不确定度为主导，其他因素可忽略不计，评估菌落总数不确定度时可只做重复性分量。增加实验次数时，可以将结果随时加到合并样本中，即可获取新的取值范围。