SLC2A9、SLC22A12、ABCG2、P2RX7基因启动子区甲基化与原发性痛风

应 颖，陈 勇，张 顺，黄海燕，李晓可，邹荣鑫，褚赞波，黄娴倩，彭 勇，干敏芝，耿保庆，朱梦雅，王筱萍

作者单位：315010浙江宁波，宁波市第二医院风湿免疫科(应颖、陈勇、黄娴倩、彭勇、干敏芝、耿保庆、朱梦雅、王筱萍)、肝细胞与再生医学实验室(张顺)；310000，宁波大学医学院(黄海燕、李晓可、邹荣鑫、褚赞波)

原发性痛风是指尿酸盐结晶在关节沉积而引起的关节疾病，由于其发病与嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄障碍所导致的高尿酸血症有关，因此属于代谢性风湿性疾病[1-2]。在全球范围内，原发性痛风和高尿酸血症的患病率呈逐年增长趋势。2012年美国原发性痛风的患病率为2.49%[3];中国2000年至2014年期间高尿酸血症的患病率约为13.3%，原发性痛风的患病率是1.1%[4]。

在过去的10年中，大量的文献包括全基因组关联分析(genome-wide association studies，GWAS)和荟萃分析均将原发性痛风发病机制研究聚焦在基因方面，许多与尿酸转运蛋白相关的基因能够通过影响肾小管对尿酸的重吸收及分泌从而影响尿酸的水平，如SLC2A9、SLC22A12、ABCG2 和SLC17A3基因[5]。也有一些与固有免疫相关的基因参与一些炎性细胞因子的产生和释放，从而导致原发性痛风的急性发作，如P2RX7基因[6-7]。

有文献指出，表观遗传学在肿瘤、糖尿病和高血压的发病机制中发挥重要作用[8-9]，基因甲基化是表观遗传学中最为常见的一种。基因甲基化是指在基因序列不发生改变的情况下，基因的表达和功能发生改变，从而产生可遗传的表型。基因甲基化主要发生在CpG岛的CG二核苷酸上，在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，胞嘧啶(C)被转化为5-甲基胞嘧啶 (5mC)。一般情况下基因甲基化会抑制基因的表达，从而导致蛋白水平下降[10]。本研究的目的是探讨尿酸转运蛋白相关基因(SLC2A9、SLC22A12 和ABCG2)和固有免疫反应相关基因(P2RX7)甲基化在原发性痛风发病中的作用，为原发性痛风的早期诊断提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2016年1月至2017年1月在宁波市第二医院就诊的50例原发性痛风患者和50例健康体检对照者，均为汉族男性。原发性痛风的诊断符合2015 ACR/EULAR 痛风分类标准[11]。健康对照组排除原发性痛风等自身免疫性疾病、糖尿病等代谢性疾病及肿瘤等。受检者之间无血缘关系，研究过程遵守赫尔辛基宣言的伦理准则，并经宁波大学医学院宁波市第二医院伦理委员会批准，患者均自愿签署知情同意书。

由两名检查人员核对并记录受检者年龄、性别、谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌酐(creatinine，CREA)、尿酸(uric acid，UA)、血糖(glucose，GLU)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、三酰甘油(triglyceride，TG)和白细胞计数(white blood cell count，WBC)。

1.2 基因甲基化水平检测方法

收集受检者外周血1 ml至质量分数2% EDTA管中。用QIAamp DNA试剂盒(Qiagen公司，德国希尔登)提取全基因组DNA，并置于 -80 ℃冰箱保存。用DNA甲基化修饰试剂盒(美国Zymo公司)对DNA进行亚硫酸盐修饰。PCR引物合成由PyroMark Assay Design 2.0设计，由华大基因合成(引物序列详见表1)。PCR反应体系20 μl，包括H2O 6.8 μl，上游引物(up 50 pmol/μl)0.6 μl，下游引物 (down 50 pmol/μl)0.6 μl，DNA 聚合酶10 μl，DNA 2 μl。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 变性30 s，X ℃ 退火40 s(SLC2A9 50 ℃，SLC22A12 52 ℃，ABCG2 48 ℃，P2RX7 56 ℃)，72 ℃ 延伸50 s，共 45个循环；72 ℃再延伸7 min。用焦磷酸检测仪(PyroMark Q96 ID，QIAGEN)进行甲基化水平检测。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般临床资料

痛风组患者CREA、UA、GLU、TG和WBC测定值均明显高于对照组，LDL-C测定值明显低于对照组，差异有统计学意义(P=0.029、<0.001、<0.001、<0.001、<0.001、0.012)，两组受检者年龄、ALT、AST、TC和HDL-C测定值差异无统计学意义(均P>0.05)(表2)。

表1 各基因引物序列Table 1 Primer sequence of various genes

表2 痛风组与对照组临床资料和实验室测定指标Table 21 Clinical findings and laboratory results between gout group and control group

2.2 各组受检者基因启动子区甲基化水平比较

两组受检者SLC2A9 pos 1-7、SLC22A12 pos 1-2、ABCG2 pos 1-6及P2RX7 pos 1-2位点的甲基化水平进行比较，痛风组受检者SLC2A9(pos1、3、4、5、7)、SLC22A12 pos 2和ABCG2(pos1、2、4、5、6)甲基化率均明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；两组间其他基因位点甲基化率比较差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

3 讨论

基因表观遗传的调控主要有以下几种：(1)基因转录过程调控；(2)基因转录后调控；(3)蛋白质翻译后调控。近年来基因表观遗传的主要研究都集中在对基因转录过程的调控环节，这部分调控又包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA调控等[12]。保持人体DNA的甲基化稳定状态十分重要，主要体现于正常细胞功能的维持、染色质结构维持、基因印记、X染色体失活、以及胚胎发育等[13-14]。DNA去甲基化是指5-甲基胞嘧啶(5mC)转变成胞嘧啶(C)。在体内，DNA去甲基化与DNA甲基化状态相互平衡，以维持人体DNA甲基化谱的稳定，该状态的失衡会导致DNA甲基化谱紊乱，引起免疫系统紊乱及肿瘤等相关疾病[15]。

果糖转运子9(glucose transporter family member 9,GLUT9)亦称为电势驱动尿酸转运蛋白1(voltage-driven urate transporter 1，URATv1)，由基因SLC2A9编码，根据氨基末端不同分为GLUT9a及GLUT9b两种亚型。GLUT9最初作为葡萄糖和果糖的转运体而被发现[16]，当细胞外K+浓度升高时，该蛋白的转运功能增强[17-18]。2008年，Vitart等[19]通过爪蟾卵模型实验在克罗地亚人群中证实尿酸质量浓度变化达1.7%～5.3%时与SLC2A9基因序列变异有关。之后的进一步研究证实GLUT9a分布于基底外侧膜，可能与尿酸盐从近端小管中排出有关，而GLUT9b则分布于顶端膜，其作用可能为协助转运尿酸盐通过顶端膜进入近端小管上皮细胞，主要介导尿酸的重吸收[20]。随后许多研究进一步证实SLC2A9基因多态性与血清尿酸水平有着密切的联系[21]。

人类尿酸转运子1(human urinary transporter 1，hURAT1)有机阴离子转运(organic anion transporter，OAT)家族中新的一员， 由555 氨基酸及12个跨膜区域组成[22-23]。hURAT1由SLC22A12基因编码，主要表达在肾小管上皮细胞的刷状缘的边缘，介导细胞外的尿酸转运至细胞内[24-25]。 Hosoyamada等[26]在SLC22A12基因敲除小鼠实验中发现，尿酸及肌酐水平与hURAT1 蛋白有关，Guan等[27]在124例原发性痛风及168例健康对照者的样本试验中亦证实SLC22A12 rs893006 多态性可能与原发性痛风的发病有关。

ABC转运蛋白G2(ATP-binding cassette superfamaily G member 2，ABCG2)是一种ATP结合转运蛋白，由6个跨膜螺旋结构域及1个单独的ATP结合域组成，广泛存在于正常组织中，发挥维持细胞稳态、减轻细胞在低氧环境下损伤的作用，属于ABC转运体家族。ABCG2基因在肾脏、胆囊、肠道上皮细胞中广泛表达[28-29]。Hosomi等[30]对亚洲的高尿酸血症患者与健康对照者进行研究，将ABCG2基因的功能分成4个等级，结果发现与健康对照组相比，高尿酸血症患者的ABCG2基因功能明显缺陷，从而证实ABCG2基因功能与尿酸排泄有着联系。进一步的研究发现，肾脏中ABCG2基因表达在近端小管上皮细胞顶膜，参与尿酸的分泌作用[31]。

表3 痛风组与对照组SLC2A9、SLC22A12、ABCG2和P2RX7基因甲基化率比较Table 3 Comparison of DNA methylation rate of SLC2A9,SLC22A12,ABCG2 and P2RX7 between gout group

P2X7受体属于嘌呤受体P2X家族，由595个氨基酸组成，具有阳离子(Na+、K+和Ca2+)选择性[32-33]。已有研究发现，P2RX7基因与系统性红斑狼疮和类风湿关节炎免疫性疾病相关[34-35]。在原发性痛风的发病中，P2X7受体主要在NF-κB途径和NALP3炎性途径中发挥重要作用[36-37]。ATP是其唯一的天然激动剂，当剧烈运动、寒冷刺激、酗酒及暴饮暴食等导致细胞外的ATP浓度发生急剧的变化时，P2X7受体被激活并开放，导致K+外流及Na+和Ca2+内流，胞内的低钾状态进一步激活NALP3炎性体，活化的caspase-1将IL-1催化为成熟的IL-1β，从而导致大量的IL-1β释放出胞外[38-42]。

在本研究中，SLC22A12基因和P2RX7基因没有CpG岛，因此选取其启动子区的位点进行甲基化率检测。在原发性痛风组中，SLC2A9(pos 1、3、4、5、7)处于低甲基化水平，可能会引起GLUT9蛋白的高表达，尿酸重吸收增加，导致血清尿酸的增加，最终可能影响痛风的发作。本实验结果可以解释痛风的发病机制，但是本研究只研究了甲基化水平与原发性痛风的关系，并没有进一步探讨SLC2A9基因表达是否与本实验的甲基化结果相符，可在今后的实验中进一步研究。SLC22A12 pos 2处于高甲基状态，可以推测hURAT蛋白的表达将会减少，尿酸的重吸收将会减少，尿酸水平降低。同样ABCG2(pos 1、2、4、5、6)处于低甲基化状态，ABCG2蛋白表达将会增加，尿酸分泌增加，尿酸水平降低。但是从SLC22A12基因和ABCG2基因的甲基化表达功能分析无法解释痛风的发病机制。痛风组与对照组P2RX7基因位点甲基化水平无明显差异，因此P2X7受体蛋白过度表达不由P2RX7基因的甲基化调控。今后研究可继续在高尿酸血症患者中进一步探讨上述基因的甲基化情况。

本研究仍有一些不足，首先，我们只研究了甲基化水平与原发性痛风的关系，并没有从机制上进一步探讨，今后可进一步探讨SLC2A9基因的表达情况是否与本实验甲基化结果相符，从而明确SLC2A9基因低甲基化是痛风的发病风险，并探讨该基因甲基化对痛风疾病的诊断价值，以做到痛风的早期诊断。其次，在本研究中，SLC22A12、ABCG2及P2RX7基因的甲基化结果不能解释痛风的发病机制，仍需要更大样本的研究去进一步验证实验结果。第三，本研究只对外周血细胞基因甲基化进行研究，对于肾脏组织以及滑膜组织的甲基化水平情况并未涉及，因此无法将不同组织细胞的基因甲基化水平进行比较。第四，本研究样本数量较少，且均来自同一个研究中心。第五，本研究没有涉及女性。第六，只对已报道的基因做了检测，可能存在其他未报道且与原发性痛风发病相关的基因。在今后的研究中，仍可通过甲基化基因芯片去筛选更多有意义的基因。第七，由于缺乏其他地区及种族上述基因的文献报道，因此无法将宁波汉族人群与其他地区进行比较。

总之，SLC2A9(pos 1、3、4、5、7)低甲基化水平可能增加原发性痛风的风险。