电针对慢性疲劳综合征大鼠行为学及大鼠脑组织病理形态学的影响

杨燕　王德龙　郭静　石天宇　屈媛媛　王月　孙维伯　杨添淞

[摘要] 目的 观察头部电针对复合因素刺激所致慢性疲劳综合征大鼠的行为学改变和海马、下丘脑组织形态学改变的影响。 方法 选取SD大鼠36只，采用随机数字表法分为正常组、模型组和针刺组，每组各12只。模型组和针刺组采用复合因素刺激的方法建立慢性疲劳综合征模型，针刺组电针百会、宁神、双侧感觉区，观察大鼠在旷场中的活动情况和大鼠海马、下丘脑组织形态变化情况。 结果 治疗前，与正常组比较，模型组和针刺组大鼠的水平活动和垂直活动明显减少（P < 0.01）；治疗后，与模型组比较，针刺组大鼠的水平活动和垂直活动明显增多（P < 0.01）。HE染色显示，治疗前，与正常组比较，模型组和针刺组大鼠海马、下丘脑神经细胞呈现形态上和数量上的病理改变，凋亡细胞数量增多，毛细血管水肿；治疗后，与模型组比较，针刺组大鼠海马、下丘脑神经细胞的病理改变有所改善。 结论 头部电针可以明显改善慢性疲劳综合征模型大鼠的中枢性疲劳状态，该作用机制可能与电针对海马、下丘脑神经元的修复有关。

[关键词] 电针；慢性疲劳综合征；旷场实验；下丘脑；海马

[中图分类号] R255.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（b）-0009-04

[Abstract] Objective To observe the effect of head electroacupuncture on behavioral changes and morphological changes of hippocampus and hypothalamus in rats with chronic fatigue syndrome induced by composite factors stimulation. Methods Thirty-six SD rats were selected and divided into the normal group， the model group and the acupuncture group by random number table， with 12 rats in each group. The model group and the acupuncture group used the composite factors stimulation to establish the chronic fatigue syndrome model. The acupuncture group was treated with electroacupuncture of baihui， ningshen and bilateral sensory areas to observe the activity of rats in the open field and the changes of tissue morphology in hippocampus and hypothalamus of the rats. Results Before treatment， the horizontal activity and vertical activity of the rats in the model group and the acupuncture group were significantly reduced compared with the normal group （P < 0.01）. After treatment， the horizontal activity and vertical activity of the rats in the acupuncture group were significantly increased （P < 0.01）. HE staining showed that the hippocampus and hypothalamus neurons in the model group and the acupuncture group showed morphological and quantitative pathological changes before treatment. The number of apoptotic cells and capillary edema was increased in the model group and the acupuncture group. The pathological changes in the hippocampus and the hypothalamus of the rats in the acupuncture group were improved after treatment. Conclusion Head electroacupuncture can obviously improve the central fatigue state of model rats with chronic fatigue syndrome， which may be related to the repair of neurons in the hippocampus and hypothalamus by electroacupuncture.

[Key words] Electroacupuncture； Chronic fatigue syndrome； Open field test； Hypothalamus； Hippocampus

慢性疲勞综合征（chronic fatigue syndrome，CFS）是一种复杂的难治性疾病，以慢性虚弱性疲劳为特征，常在用力后加重，经充分休息不能缓解、病程进展缓慢，迁延不愈，其常见伴随症状有肌肉酸痛、咽喉肿痛、关节活动不利等躯体感觉不适，以及抑郁、焦虑、睡眠障碍等精神异常[1]。目前关于本病的病因病机、诊断和治疗均不明确，其发病机制可能与神经、免疫、精神等因素相关[2-4]。中医认为本病与五脏功能虚损、气血阴阳不足有关，临床上针刺对于本病的治疗具有显著疗效[5]。本研究通过观察电针大鼠百会、宁神、双侧感觉区对大鼠行为学及下丘脑、海马形态的影响，进一步阐明电针治疗CFS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性清洁SD大鼠36只，体重180～220 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK黑2008-004。

1.1.2 仪器 6805-Ⅱ电针仪（常州市武进长城医疗器械有限公司）；摄像机（HDR-PJ200，日本索尼公司）；旷场箱（黑龙江中医药大学实验中心自制）；2135型切片机（德国菜卡）；moticam3000显微摄影系统（美国motic）；电热恒温箱（上海一恒）；大鼠声光电刺激实验装置（黑龙江中医药大学实验中心自制）；TES-1350A型噪音机（台湾泰仕）。

1.2 方法

大鼠适应性饲养1周后，将36只大鼠采用随机数字表法分为正常组、模型组和针刺组，每组各12只。根据CFS多因素致病的特征，参考相关文献[6-8]采用复合因素刺激的方式对模型组和针刺组进行造模，正常组常规饲养，不做处理。造模成功标准参考高怀林等[9]疲劳评分量表，即动物出现精神倦怠，嗜卧，皮毛稀疏失去光泽，眼神黯淡无光，身体逐渐消瘦，自主活动明显减少，眯眼明显，粪便稀，反应力明显降低，则说明造模成功。

1.2.1 负重力竭游泳 正式造模前，先將大鼠置于深35 cm的水池中[水温（25±2）℃]适应性游泳3 d，每日1次，每次游泳20 min。适应后，将大鼠负重自身体重5%的重物，游泳至力竭，每日1次，连续游泳28 d。

1.2.2 慢性应激刺激 大鼠力竭游泳后给予包括禁水12 h、禁食12 h、通宵照明、夹尾（1 min）、噪声刺激（110 dB，1 h）的不可预知的应激刺激，以上刺激每天随机给予2种，以避免适应发生。

1.3 电针干预

造模成功后，对针刺组进行电针治疗。选穴：百会、宁神、双侧感觉区，参照《实验针灸学》[10]动物标准穴位图谱取穴。针具：0.35 mm×25 mm安迪牌针灸针。治疗方法：于大鼠针刺部位常规剪毛消毒，用毫针在百会、宁神、感觉区（双）处快速刺入皮下15 mm，接6805-Ⅱ电针仪调至连续波，电针治疗每日1次，每次30 min，连续治疗15 d，正常组和模型组不给予任何治疗，模型组每天给予针刺组相同时间捆绑，排除由针刺时捆绑造成的误差。

1.4 一般情况观察

造模和治疗期间，每天观察并记录大鼠的饮水量、进食量、体重、大鼠粪便及皮毛色泽、休息时身体的姿势变化等情况。

1.5 行为学观察

治疗前和治疗后分别进行旷场实验评估，具体操作为：将大鼠依次放入高60 cm、底面100 cm×100 cm的旷场箱中，旷场箱的底面平分为25个小方格，记录大鼠在3 min内的活动情况，包括水平运动得分（即3 min内穿越格子数）和垂直运动得分（即后肢站立次数）。

1.6 病理形态学观察

1.6.1 取材 实验结束后，实验动物经10%水合氯醛麻醉后，用4℃生理盐水经心灌注，当循环液体颜色变清时，换用冷的4%多聚甲醛PBS液继续灌注固定，直至大鼠四肢肌肉发硬僵直，肝、肺逐渐变白停止心脏灌注，断头取脑，放入4%多聚甲醛溶液中备用。

1.6.2 脑组织切片制备 冰盘上将固定好的大鼠脑组织分别取海马和下丘脑，流水冲洗后常规石蜡包埋，连续冠状切片，切片厚5 μm，展片捞起，置于60℃烘箱中12 h，取片进行HE染色，并于镜下观察。

1.7 统计学方法

应用SPSS 18.0软件包进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

28 d后，模型组、针刺组大鼠出现体重下降、食量下降、皮毛脱落、眯眼懒动、大便不成形等表现，提示造模成功，通过15 d的治疗，与模型组比较，针刺组大鼠饮水、进食量基本恢复正常，精神尚可，皮毛颜色较有光泽，体重有缓慢增长，自主活动增加，粪便均正常。

2.2 旷场实验结果

治疗前，模型组和针刺组大鼠水平活动和垂直活动的次数均明显少于正常组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。治疗15 d后，针刺组的水平活动和垂直活动的次数均明显多于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。治疗后，针刺组水平活动和垂直活动次数均明显多于治疗前（P < 0.05），而正常组、模型组与治疗前比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.3 HE染色结果

光镜下观察，模型组大鼠海马、下丘脑区神经细胞排列紊乱，形态欠规整，胞质胞核染色欠清晰；胶质细胞数目稍增多，凋亡小体数目增多；神经纤维结构疏松，炎症细胞数目明显增多。与模型组比较，针刺组大鼠海马、下丘脑区神经细胞排列较规整，胞质胞核较清晰，凋亡小体和胶质细胞数目有所减少，毛细血管水肿程度和炎症细胞数量有所减轻。见图1。

3 讨论

目前，对CFS的发病机制研究尚未阐释清楚，但有研究表明，CFS常由多重因素共同致病[1]。介于发病机制的复杂性和临床表现的多样性，目前对于本病研究的动物模型制备并无统一标准，制备的模型也无法完全模拟CFS的全部症状，本研究选用多因素复合刺激的造模方式，最大限度地模拟了CFS的多重应激机制。

在治疗方法上，本研究采用头针结合电刺激，可加强针刺作用，更有效地改善大脑功能[11-12]。头为诸阳之会，针刺头部腧穴能激发人体阳气，使气血运行通畅，脏腑功能得复。其中百会又称“三阳五会”汇集手足三阳脉和五脏之精，具有保健强壮、醒神开窍的作用。宁神，位于督脉神庭与印堂中点[13]，解剖位置位于大脑前额叶在体表的投影区，具有宁心安神、调节情志的作用，感觉区位于运动区（运动区上点位于前后正中线中点后0.5 cm；下点为眉枕线和鬓角发际前缘相交处）向后1.5 cm的平行线，解剖位置为中央后回在体表的投影，可缓解肢体疼痛及感觉异常。头部电针治疗复合因素诱导的CFS大鼠，既能疏通经脉，激发阳气，醒脑开窍，又能调节针刺相对应的额顶叶大脑功能。

本研究过观察动物造模过程中的状态变化和在旷场实验中的运动情况来反映造模情况和针刺疗效。通常大鼠在旷场中的水平运动得分反映了大鼠的运动能力，而垂直运动得分则反映大鼠对外界环境的好奇心和探索能力[14]。本研究中，治疗前，模型组和针刺组与正常组比较，垂直运动和水平运动次数明显减少（P < 0.01），提示大鼠自主活动能力下降。治疗后，模型组大鼠垂直、水平活动次数与治疗前无明显差异，而针刺组大鼠垂直、水平运动次数明显多于治疗前及模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01），这提示模型组大鼠自主活动能力没有明显改善，而针刺治疗对CFS大鼠疲劳状态有明显改善作用。

在CFS的机制研究方面，神经内分泌与CFS的关系已经成为了近年来的研究热点[15]，研究中，大部分集中在下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）的调节机制上，CFS患者多存在HPA功能低下[16-17]，表现为HPA轴对应激因素的低敏感性、对糖皮质激素的高敏感性和HPA轴激素的低水平分泌，而下丘脑作为HPA轴功能启动的关键环节，其功能状态与CFS的发生发展密切相关[18]。根据CFS患者表现出的健忘、注意力不集中等精神障碍，可推测海马作为学习记忆的中枢调节环节，其病理形态学改变可能与CFS 的发生有关。本研究对大鼠海马、下丘脑进行HE染色，探究头部电针对海马、下丘脑病理形态学变化的影响，经过15 d的治疗，与模型组比较，针刺组大鼠海马及下丘脑HE染色显示神经细胞形态改善，凋亡细胞数目减少，毛细血管水肿减轻，提示头部电针可以减少CFS大鼠海马和下丘脑区炎症细胞浸润，抑制神经元凋亡，减轻神经细胞病理变化，从而起到缓解疲劳症状、改善学习记忆功能的作用。本研究提示针刺可以通过改善CFS大鼠脑组织病理形态学而起作用，其分子机制仍有待于进一步深入研究。

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（收稿日期：2018-04-25 本文编辑：张瑜杰）