糖络宁对糖尿病大鼠背根神经节线粒体超氧阴离子产生及线粒体膜电位水平的影响

刘琴　李逸潇　张涛静　龚燕冰　周晖　谢培凤

[摘要] 目的 觀察中药复方制剂糖络宁对糖尿病大鼠背根神经节（DRG）线粒体呼吸链氧化呼吸功能、超氧阴离子产生量及膜电位水平的影响。 方法 选取SPF级雄性8周SD大鼠80只，随机选择14只为正常组，其余66只大鼠采用链脲佐菌素制作糖尿病大鼠模型；其中61只造模成功大鼠采用随机数字表法分为模型组19只、西药组（α-硫辛酸组）21只、中药组（糖络宁组）21只，共给药8周；给药结束后，检测线粒体呼吸链氧化呼吸功能、超氧阴离子产生量及膜电位水平。 结果 与正常组比较，模型组大鼠DRG线粒体呼吸功能明显下降（P < 0.01）；与模型组比较，西药组大鼠DRG线粒体呼吸功能明显改善（P < 0.01）；与模型组比较，中药组大鼠DRG线粒体呼吸功能未见明显改善（P > 0.05）。与正常组比较，模型组大鼠DRG线粒体超氧阴离子明显升高（P < 0.01）；与模型组比较，中药组、西药组大鼠DRG线粒体超氧阴离子水平明显降低（P < 0.01）。与正常组比较，模型组大鼠线粒体膜电位明显下降（P < 0.01）；与模型组比较，中药组、西药组大鼠线粒体膜电位明显改善（P < 0.01）。 结论 糖络宁不能改善糖尿病大鼠DRG线粒体氧化呼吸功能，可抑制糖尿病大鼠DRG线粒体超氧阴离子的产生，改善线粒体膜电位水平，这可能是糖络宁治疗糖尿病周围神经病变的作用机制。

[关键词] 糖络宁；糖尿病大鼠；氧化呼吸功能；超氧阴离子；线粒体；膜电位

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（b）-0004-05

[Abstract] Objective To observe the effect of Chinese herbal compound Tang-luo-ning on oxidative respiratory function of the mitochondrial respiratory chain， superoxide anion production and membrane potential in diabetic rat dorsal root ganglion （DRG）. Methods There were 80 SD male rats， 14 of them were randomly selected as the normal group. The rest 66 were used to established diabetic rats model by injected Streptozocin （STZ）. According to the random number table， the 61 rats of the model were divided into model group with 19 rats， Western medicine group （alpha lipoic acid group） with 21 rats and traditional Chinese medicine group （Tang-luo-ning group） with 21 rats. They were given the medicine 8 weeks， then mitochondrial respiratory chain oxidative respiratory function， superoxide anion production and membrane potential levels were measured. Results Compared with the normal group， the mitochondrial respiratory function of the DRG in the model group was significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the model group， the mitochondrial respiratory function of the DRG in the Western medicine group was significantly improved （P < 0.01）. Compared with the model group， the Chinese medicine group had no significant improvement in mitochondrial respiratory function in DRG（P > 0.05）. Compared with the normal group， the mitochondrial superoxide anion of the DRG in the model group was significantly increased （P < 0.01）. Compared with the model group， the mitochondrial superoxide anion level of the DRG in the Chinese medicine group and the Western medicine group was significantly reduced （P < 0.1）. Compared with the normal group， the mitochondrial membrane potential of the model group was significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the model group， the mitochondrial membrane potential of the Chinese medicine group and the Western medicine group was significantly improved （P < 0.01）. Conclusion Tang-luo-ning inhibits the generation of superoxide anion and ameliorates mitochondrial membrane potential in dorsal root ganglions of diabetic rats. This study provides a potential mechanism underlying protection of Tang-luo-ning on the injury of dorsal root ganglions in diabetic model.

[Key words] Tang-luo-ning； Diabetic rats； Oxidative respiratory function； Superoxide anion； Mitochondria； Membrane potential

糖尿病性周圍神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最常见慢性并发症之一，发病率高，有近半数患者无明显症状[1]。神经病变可累及感觉神经、运动神经及植物神经，产生疼痛、麻木、运动障碍及自主神经功能障碍，影响糖尿病患者的生存质量[2]。氧化应激在DPN的发病中起着关键性的作用，尤其是神经细胞内最重要的产能细胞器——线粒体所导致的氧化应激，被认为是DPN发病的重要机制。高血糖状态下，神经细胞线粒体呼吸链的氧化呼吸功能、超氧阴离子的产生量以及线粒体膜电位均会发生改变，进而导致线粒体中氧化应激反应增强，引发DPN。

中药复方制剂糖络宁治疗DPN效果显著，通过对200例患者进行临床观察，糖络宁的治疗有效率达91.67%[3-5]，显著高于对照组（口服甲钴胺）的62.5%。糖络宁对DPN患者的肢体麻木、疼痛、痉挛、踝反射减弱等神经系统症状改善明显，对神经传导速度和末梢微循环积分有明显的改善作用，但其作用机制仍不明确。本研究针对上述线粒体导致DPN的发病机制，观察糖络宁对糖尿病大鼠背根神经节细胞线粒体呼吸链的氧化呼吸功能、超氧阴离子的产生量以及线粒体膜电位的影响，从而探讨其治疗DPN的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雄性8周SD大鼠，体重200～250 g，合格证号：SCXK（京）2012-0001，由北京维通利华试验动物技术有限公司供给。购入后置于北京中医药大学动物实验中心饲养。实验室条件：国标GB14925_2001规定动物实验设施大鼠SPF级屏障环境[环境安全合格证号：SYXK（京）2011-0024]，室内相对温度（25±1）℃，相对湿度（60±10）%。实验前大鼠适应性喂养2周。

1.1.2 试剂 链脲佐菌素（STZ，美国Merck公司，批号：B69776）；线粒体相关试剂盒（上海杰美基因医药科技公司）；动物细胞/组织活性线粒体分离试剂盒（GMS1 0006.2 v.A）、纯化线粒体冻存液（酶学和膜结构保护）（GMS12198.1）、纯化线粒体冻存液（生物能量学保护）（GMS12198.2）、纯化线粒体氧化应激活性氧（ROS）光泽精化学发光法定量检测试剂盒（GMS10113.2 v.A）；ADP（Sigma，01905）；氯化钾、甘露醇、蔗糖、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TRIS-HCl）、磷酸氢二钾、琥珀酸、TRIS-Base（以上试剂分析提纯由国药集团化学试剂北京有限公司提供）；α-硫辛酸（α-lipoic acid）（批号：82159-09-9）。

1.2 实验方法

1.2.1 造模及分组 SPF级雄性8周SD大鼠80只，体重200～250 g。实验前大鼠适应性喂养2周。造模前随机选择14只为正常组，其余大鼠予STZ 60 mg/kg腹腔注射，72 h后测血糖≥16.7 mmol/L为造模成功[6-8]，最终造模成功61只，将造模成功大鼠采用随机数字表法分为模型组、西药组、中药组，每组大鼠数量分别为19、21、21只。

1.2.2 给药方法 中药组给予糖络宁制剂（北京中医药大学东方医院制剂室自制，约为生药10 g/mL，方药组成：丹参、全蝎、生黄芪、牛膝、狗脊等）按生药5 g/（kg·d）灌胃，换算成糖络宁为0.5 mL灌胃；西药组给予α硫辛酸按20 mg/（kg·d）灌胃，使用时将α硫辛酸用蒸馏水配成混悬液2.5 mg/mL；模型组及正常组予等量生理盐水灌胃，实验期间自由饮食，连续给药8周。

1.2.3 取材 给药结束后，根据大鼠体肌重，以10%水合氯醛按350 mg/kg标准腹腔注射麻醉。麻醉成功后，分离大鼠双下肢肌肉组织，取出两侧背根神经节组织，生理盐水冲洗后EP管中保存，置-80℃备用。按照试剂盒及既往研究[9-10]方法提取大鼠背根神经节线粒体，放入-70℃冰箱里备用。

1.3 观测指标

1.3.1 线粒体呼吸链氧化呼吸功能的测定 提取分离大鼠神经组织线粒体，运用Hansatech公司的Oxytherm液相氧电极仪，使用极谱描记术Clark电极法对线粒体呼吸功能进行检测：①先将恒温水浴调至25℃，用注射器将反应液（1.8 mL）注入反应室，然后加入0.2 mL线粒体制备液，此时记录仪上出现斜率较低的直线，这是线粒体的内源呼吸，又称状态Ⅰ。②待斜率稳定后加入适量呼吸底物琥珀酸，这种加入呼吸底物后的斜率为呼吸基质存在时的氧吸收速率又称状态Ⅱ。③再加入ADP时出现较大的斜率，代表ADP促进下的线粒体呼吸速率，称为状态Ⅲ。④当磷酸化反应的底物ADP被耗尽后，线粒体氧化吸收速率又自动地降低，此时的斜率为状态Ⅳ。⑤线粒体呼吸功能计算：状态Ⅲ的斜率与状态Ⅳ的斜率比值。

1.3.2 线粒体超氧阴离子产生量的测量 提取分离大鼠DRG线粒体，使用光泽精化学发光法对线粒体超氧阴离子进行定量检测：①移取100 μL的纯化线粒体，加入700 μL GENMED缓冲液（Reagent A），轻轻混匀线粒体，放进37℃恒温水槽孵育10 min；②打开化学发光仪，设定仪器内温度为37℃预热和整合测读分别为10 s及15 min，然后关掉实验室的灯光，将-20℃冰箱里的GENMED发光液（Reagent B）置入冰槽里融化，严格置于暗室内；③移取400 μL GENMED缓冲液（Reagent A）、上述预处理的线粒体分别移到阴性对照测试管、样品本底测试管；④移取400 μL上述预处理的线粒体到样品活性测试管，分别加入10 μL GENMED发光液（Reagent B）到上述测试管，除样品本底测试管外；⑤轻轻混匀，放进37℃化学发光仪里读测，整合测读15 min/0.4（mL：样品容量）=相对发光单位（RLU）/0.2 mg线粒体蛋白。

1.3.3 线粒体膜电位的测量 ①从纯化的线粒體样品中移出10 μL纯化线粒体到新的预冷的1.5 mL离心管，置入冰槽里。②加入适量的GENMED 保存液（Reagent A）至最终容量为100 μL。③加入100 μL含有GENMED染色液（Reagent B）和GENMED稀释液（Reagent C）的GENMED染色工作液到比色杯里。④加入100 μL纯化的线粒体样品，上下倾倒比色杯，轻轻混匀，再放进暗室里，在室温下孵育10 min。⑤即刻放进荧光分光光度计测定：激发波长490 nm，散发波长590 nm，获得相对荧光单位（RFU），RFU值反映线粒体膜电位水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 11.5统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多个样本均数间的两两比较采用q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠DRG线粒体呼吸链氧化呼吸功能的测定结果

与正常组比较，模型组大鼠DRG线粒体呼吸功能明显下降，差异有高度统计学意义（P < 0.001）；与模型组比较，西药组大鼠DRG线粒体呼吸功能明显改善，差异有高度统计学意义（P < 0.001）；与模型组比较，中药组大鼠DRG线粒体呼吸功能未见明显改善（P > 0.05）。见图1～2。

2.2 大鼠DRG线粒体超氧阴离子产生量的测量结果

与正常组比较，模型组大鼠DRG线粒体超氧阴离子明显升高，差异有高度统计学意义（P < 0.001）；与模型组比较，中药组、西药组大鼠DRG线粒体超氧阴离子水平明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01或P < 0.001）。见图3。

2.3 大鼠DRG线粒体膜电位测定结果

与正常组比较，模型组大鼠线粒体膜电位明显下降，差异有高度统计学意义（P < 0.001）；与模型组比较，中药组、西药组大鼠线粒体膜电位明显改善，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图4。

3 讨论

DPN是糖尿病常见的慢性并发症，以下肢对称性麻木发凉为主要表现，是导致糖尿病患者生活质量下降甚至致残的原因之一。DPN的发病机制至今尚未完全阐明。研究认为氧化应激是DPN的核心发病机制[11-12]，线粒体氧化应激在其中发挥着巨大的作用。生理状态下，线粒体是神经细胞内直接利用氧气制造能量最主要的部位，90%以上吸入神经元的氧气被线粒体消耗。氧是个“双刃剑”，一方面细胞利用氧分子制造能量，另一方面氧分子在被利用的过程中会产生极活泼的中间体（活性氧自由基）伤害神经细胞造成氧毒性。大量研究表明，在高血糖状态下，这种氧毒性更加明显，线粒体便成为神经细胞内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）最主要来源[13-15]。

针对氧化应激这一DPN发病的核心机制，抗氧化应激治疗自然成为治疗DPN的热点。在抗氧化药物中，α-硫辛酸是目前临床最为常用的药物。α-硫辛酸最早在动物实验中被证实具有很好的治疗DPN的效果[16-18]，其后在人体上的RCT研究同样证实其临床疗效，尤其是Ametov等[19]与Ziegler等[20]所做的多中心、随机、双盲、安慰剂对照试验。α-硫辛酸已成为治疗DPN的一线治疗用药，故本研究将其作为西药对照药物。

本研究针对线粒体氧化应激，观察糖络宁对线粒体氧化呼吸功能、超氧阴离子及膜电位的影响。结果显示，糖尿病大鼠DRG线粒体呼吸功能下降明显，α-硫辛酸可部分改善DRG线粒体呼吸功能，糖络宁不能改善糖尿病DRG大鼠线粒体呼吸功能；糖尿病大鼠DRG线粒体超氧阴离子产生量较正常大鼠明显增加，而西药α-硫辛酸与中药糖络宁均可明显抑制糖尿病大鼠DRG线粒体超氧阴离子的产生，其中硫辛酸抑制更加明显；糖尿病大鼠DRG线粒体膜电位水平较正常大鼠明显下降，而线粒体膜电位下降与细胞凋亡密切相关；与糖尿病大鼠比较，使用中药糖络宁与西药α-硫辛酸治疗的大鼠均可显著提高线粒体膜电位水平，进而改善细胞凋亡。

综上所述，本研究发现糖络宁可抑制DRG线粒体超氧阴离子的产生，从而直接减少线粒体中氧化应激的产生，同时改善线粒体膜电位，减少DRG细胞凋亡的发生，这两点可能是糖络宁治疗DPN的作用机制之一。但遗憾的是，糖络宁未能恢复糖尿病大鼠受损的线粒体呼吸功能，可能是由于糖络宁的作用靶点不在线粒体呼吸功能上。

[参考文献]

[1] 中华医学会糖尿病分会.2013年中国2型糖尿病防治指南[J].中华糖尿病杂志，2014，6（7）：469-470.

[2] Pop-Busui R，Boulton AJ，Feldman EL，et al. Diabetic neuropathy：a position statement by the American Diabetes Association [J]. Diabetes Care，2017，40（1）：136-154.

[3] 高彦彬，吕仁和，于秀辰，等.糖络宁治疗糖尿病周围神经病变临床观察[J].北京中医药大学学报，1997，27（4）：50-53.

[4] 周晖，高彦彬，刘铜华，等.糖络宁治疗糖尿病周围神经病变的临床研究[J].北京中医药大学学报，2002，32（4）：59-61.

[5] 高彦彬，周晖，张涛静，等.糖络宁治疗糖尿病周围神经病变临床研究[J].中华中医药杂志，2013，28（6）：1673-1677.

[6] 彭芳，杨远华.实验性糖尿病动物模型制备及指标测定评价[J].大理学院学报，2003，2（1）：1-3.

[7] 林心君，王麒又，辛金钟，等.高成模率和高稳定性的糖尿病大鼠模型制备——高脂高糖膳食+STZ体重联合体表面积法构建糖尿病大鼠模型[J].中国老年学杂志，2013，33（9）：2051-2054.

[8] 洪丽莉，许冠荪，申国明，等.SD大鼠2型糖尿病模型的建立[J].实验动物科学与管理，2005，（4）：1-3.

[9] 张涛静，龚燕冰，周晖，等.糖络宁对STZ诱导糖尿病大鼠背根神经节线粒体抗氧化剂活性的影响[J].疑难病杂志，2015，14（2）：179-181.

[10] 张秀丽，于德江，刘德胜，等.梓醇对鱼藤酮致小鼠中脑和纹状体线粒体酶活性改变的改善作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2012，26（5）：618-623.

[11] 牟忠卿，陈丽.糖尿病中氧化应激的研究进展[J].国外医学：内科学分册，2005，32（12）：510-512，524，529.

[12] 孙青.中药筋脉通对糖尿病周围神经病变大鼠氧化应激及细胞凋亡的影响[D].北京：清华大学医学部，北京协和医学院，中国医学科学院，2012.

[13] Akude E，Zherebitskaya E，Chowdhury SK，et al. Diminished superoxide generation is associated with respiratory chain dysfunction and changes in the mitochondrial proteome of sensory neurons from diabetic rats [J]. Diabetes，2011，60（1）：288-297.

[14] Roy CSK，Zherebitskaya E，Smith DR，et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in dorsal root ganglia of Streptozotocin-induced diabetic rats and its correction by insulin treatment [J]. Diabetes，2010，59（4）：1082-1091.

[15] Akude E，Zherebitskaya E，Roy CSK，et al. 4-Hydroxy-2-nonenal induces mitochondrial dysfunction and aberrant axonal outgrowth in adult sensory neurons that mimics features of diabetic neuropathy [J]. Neurotox Res，2010， 17（1）：28-38.

[16] Vincent AM，Russell JW，Low P，et al. Oxidative stress in the pathogenesis of diabetic neuropathy [J]. Endocr Rev，2004，25（4）：612-628.

[17] Ziegler D，Sohr CGH，Nourooz-Zadeh J，et al. Oxidative stress and antioxidant defense in relation to the severity of diabetic polyneuropathy and autonomic neuropathy [J]. Diabetes Care，2004，27（9）：2178-2183.

[18] 王俐，蔡美琴，刘秀玲，等.α-硫辛酸对高糖和H2O2致ECV304细胞线粒体氧化损伤的保护作用[C].//第九届长三角科技论坛暨营养科技论坛论文集，上海交通大学上海市预防医学研究院，2012：24-29.

[19] Ametov A，Barinov A，Ziegler D，et al. The sensory symptoms of diabetic polyneuropathy are improved with α-lipoic acid：the SYDNEY trial [J]. Diabetes Care，2003，26（3）：770-776.

[20] Ziegler D，Ametov A，Barinov A，et al. Oral treatment with α-lipoic acid lmproves symptomatic diabetic polyneuropathy：the SYDNEY 2 trial[J]. Diabetes Care，2006，29（11）：2365-2370.

（收稿日期：2018-03-13 本文編辑：任 念）