高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学研究中的应用

孙凤春 王微 王靖

【摘要】用宏基因组技术研究不同比例锯末牛粪堆肥产物中微生物的组成和分布。结果表明，牛粪与锯末质量比为2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1的3个堆肥样本中微生物可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）有较大的差异，其中含量最高的3个门的微生物为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门，在不同样本中它们的含量也有较大差异。从属水平分析，含量最高的是甲基单胞菌属、噬氢菌属、固氮菌属和寡养单胞菌等营养转化和合成的菌属。降解纤维素和木质素的也有一定的含量，特别是假单胞菌属含量较高。经过对堆肥产物基本性质及其微生物的分析发现，当牛粪与锯末的比例为2 ∶1时，堆肥样品中的营养转化和合成菌属以及去除污染菌属都高于其他2个样品，堆肥效果较好。

【关键词】牛粪堆肥；宏基因组；微生物；锯末；可操作分类单元（OUT）；分子生态学依据

【中图分类号】R181.3+2 【文献标识码】B 【文章编号】2095-6851（2018）10-051-02

近年来，由于产业结构调整，我国规模化养殖业发展迅速。以生产牛奶为主的奶牛养殖业产生了可观的经济效益，但是同时也带来了大量的牛粪等固体有机废弃物，为了保护环境、实现养殖业的可持续发展，必须进行牛粪的无害化处理和资源化利用，堆肥处理是目前有机固体废物处理的重要方式。堆肥的本质是微生物群落结构演替协同作用于堆肥基质的生化过程。在细菌和真菌等微生物的作用下，降解有机物，杀死病原菌，促进有机质稳定化和腐殖化，最终达到无害化和资源化的目的，并生成大量可被植物吸收利用的有效态氮、有效态磷、有效态钾化合物和其他有机物质作为土壤肥力活性物质。因此，研究微生物的群落结构对于了解微生物的协同关系、调控堆肥以及研究高效稳定的复合菌系都有重要意义。堆肥过程中的微生物菌系复杂，变化较大，而且其中大多数菌系不能分离培养，因而常规的试验方法和手段难以完全认识和真实反映微生物的群落组成。宏基因学技术分析克服了传统微生物分析仅限于可分离培养组分的缺陷，通过对样品中微生物基因序列的分析，可以快速确定微生物的种类和丰度，主要采用16S rDNA序列分析进行微生物的群落分析检测出样品中大量的低丰度生物。目前，宏基因組学技术已经应用于海洋、土壤、石油以及人体胃肠道等多个方面，但用于堆肥研究的较少。在牛粪堆肥中，通常以农作物秸秆、木质、锯末废弃物等作为辅料，起到加速堆肥过程和保证堆肥效果的作用。本研究就地取材，在牛粪中添加不同比例的锯末，采用宏基因组学技术对不同比例锯末添加产生的微生物进行对比分析，旨在明确堆肥微生物的群落组成，合理评价堆肥效果，为堆肥工艺研究应用提供一定的分子生态学依据。

1 材料与方法

1.1 堆肥试验及样品采集

试验所用的牛粪和锯末分别从湖南省武汉市南湖养殖场和永宏木材加工厂收集（锯末作为调节剂）。堆肥试验在实验室内进行，以锯末为调理剂，与牛粪充分混合后进行堆肥试验，设置柱体高度为0.8 m，直径为0.5 m，实行人工翻堆通气，每3 d进行1次手工翻堆。在3个相同的堆肥容器内，将牛粪与锯末分别按照2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1比例混合，堆肥45 d时取样，分别在每个柱体的上、中、下采集样品，然后将3个取样点的样品混合为1个样品，3个堆肥容器所取的样品分别编号为1、2、3号样品。

1.2 数据分析方法

1.2.1 测序获得序列的质量控制在试验过程中，测序产物可能含有非特异性扩增片段，利用特异性引物信息可以将其去除；序列中可能含有模糊碱基、单碱基高重复区以及PCR过程中产生的一些嵌合体，将这些序列纳入分析范围会降低分析质量，因此去除此部分序列，可得到供精准分析的优化序列。

1.2.2 可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）分析首先提取非重复序列，碱基完全一致序列为重复序列只保留1条；然后与SILVA v119数据库（http：//www.arb-silva.de/）中的aligned（16S/18S，SSU）核糖体序列比对，使用uchime软件检测PCR扩增中产生的嵌合体序列（Chimeric序列）并去除嵌合體序列；最后使用mothur V.1.33.3软件进行距离计算与OTU聚类分析。OTU是在系统发生学或群体遗传学研究中为了便于分析，人为给某一个分类单元（品系、属、种、分组等）设置的同一标志。要了解一个样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就须要对序列进行聚类操作（cluster）。通过聚类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，1个小组就是1个OTU。可根据不同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，通常在97%的相似水平下对OTU进行生物信息统计分析。在进行OTU分类学分析时，首先将每一条优质序列都与数据库进行比对，找出其最相近且可信度达80%以上的种属信息；之后将每一个OTU中的所有序列进行类比，找出同一OTU中不同序列的最近祖先的种属信息。将OTU综合分类表中的信息按照门、纲、目、科、属、种6个水平分别提取信息，分别统计各样品在不同分类水平上的相对丰度。

2 讨论

肠道疾病最有效的检查方法是结肠镜检查，诊断和干预治疗效果好，但是肠镜直接插入体内，会给患者带来许多不适和疼痛，会给予患者生理上和心理上的伤害，随着医疗水平的提高，肠镜的使用，有效改善了肠道疾病的诊断和治疗，但是其并发症等方面还有着局限性。

在结肠镜检查前的肠道准备中实施综合性护理干预，临床价值非常明显，本研究中观察组肠道清洁度高，肠镜检查所需时间少，一次插镜成功率高（98.59%、80.28%），并发症发生率低（9.86%、35.21%），差异均有统计学意义（P<0.05）。表明在结肠镜诊疗前肠道准备中，护理方法不同，肠道清洁度不同，应综合考虑患者的病情，实施个体化护理，促进患者肠蠕动，以期提高结肠镜检查效果。

综上所述，综合护理干预在结肠镜诊疗前肠道准备中临床效果良好，提高了肠道清洁度，缩短了检查时间，降低了并发症的发生，促进患者早日康复出院，值得临床推广。

参考文献：

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