小鹅瘟卵黄抗体酸化水脱脂工艺优化

胡瑞鸿，丛秋实，李艳飞

（1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030；2.哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

卵黄免疫球蛋白（Immunoglobulin of yolk，IgY）是母鸡受免疫刺激后将血清中相应特异性IgG选择性转移至卵黄蓄积而成[1]。鸡卵黄中含48%水、17.6%蛋白质和30%脂肪[2]，脂肪易与蛋白质结合形成脂蛋白[3]。传统粗制卵黄含有大量外源非水溶性蛋白及磷脂等大分子，提取卵黄抗体必须脱脂处理[4]，抗体纯度、效价是影响小鹅瘟抗体使用效果的关键因素[5]。

国内研究除脂方法主要有水稀释法、聚乙二醇沉淀法、硫酸葡聚糖沉淀法、天然树胶沉淀法、氯仿、苯酚、辛酸等有机溶剂抽提沉淀法以及超滤、超临界萃取法与冻融等物理化学方法[6]。Kim与Hatta等利用非离子型表面活性剂原理，采用聚乙二醇6000和泊洛沙姆使卵黄液脱脂，破坏卵黄脂类水化膜，打破卵黄乳化状态，卵黄脂类互相凝结形成沉淀，实现脂水分离[7-8]。若两种活性剂浓度过高，破坏抗体蛋白水化膜，形成沉淀，影响抗体效价[9-10]。但上述方法除脂工艺流程长、步骤多、试剂消耗量大，须去除残留化学物质[11]。因此，研究无毒、无害、除脂效率高且除脂后对卵黄抗体影响最小的方法具有重要意义。

本试验研究酸化水不同稀释度、pH、存放时间及离心力对除脂率及卵黄免疫球蛋白提取的影响，筛选同条件下，脱脂率、琼扩效价及蛋白浓度最高的参数组合，旨在确定适用于小鹅瘟卵黄抗体脱脂工艺优化条件，为小鹅瘟卵黄抗体规模化生产提供理论依据及试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小鹅瘟卵黄抗体高免鸡蛋：按照既定免疫程序，免疫合格产蛋鸡，收集鸡蛋[12]。

0.12 mol·L-1（pH 5.0）醋酸盐缓冲液、0.1 mol·L-1（pH 7.2）PBS、辛酸（CP）、硫酸铵（AR）。

小鹅瘟阳性血清：东北农业大学动物免疫学实验室惠赠。

小鹅瘟琼扩抗原：哈药集团生物疫苗有限公司制备。

1.2 方法

1.2.1 IgY抗体测定

1.2.1.1 操作方法

将制备琼脂板按模板用打孔器打孔，挑出孔中琼脂。中心1孔，周围6孔，孔径3 mm，孔距4 mm（见图1）。中央孔加入标准琼扩抗原，1孔加入标准阳性血清，3、5孔加入倍比稀释产品。各孔均加满（25 μL）。将加样后琼脂板放入填有纱布湿盒内，置于37℃，24 h首次判定，72 h最终判定。

图1 琼脂扩散试验Fig.1 Agar diffusion test

1.2.1.2 判定标准

当标准阳性血清孔与抗原孔之间形成清晰沉淀线时，被检产品与抗原孔之间出现沉淀线，被检血清判为阳性；当标准阳性血清孔与抗原孔之间形成清晰沉淀线，被检产品孔与抗原孔之间无沉淀线出现时，被检血清判为阴性；当被检产品最高稀释度孔与抗原孔之间形成清晰沉淀线时，即判为被检产品的琼扩效价，小鹅瘟琼扩效价应不低于1：16。

1.2.2 脂肪含量测定

用香草醛显色法测定[13]。

1.2.3 蛋白含量测定

考马斯亮蓝染色法测定[14]。

1.2.4 电泳分析

SDS-PAGE电泳检查[15]、分离胶浓度12%、浓缩胶浓度5%、电压120 V、考马斯亮蓝R-250染色。

1.2.5 IgY提取

以酸化水、辛酸-硫酸铵法提取IgY。卵黄经酸化水稀释除脂后，加入1.5%辛酸，搅拌混合，1 900 g离心30 min后，加入33%硫酸铵，搅拌混合，经1 900 g离心20 min后，加入pH 7.2 PBS溶解沉淀，置4℃冰箱内保存。

1.2.6 除脂主要影响因素

1.2.6.1 酸化水稀释度对除脂率的影响

每组取10个鸡蛋卵黄液，分别用0.12 mol·L-1醋酸盐缓冲液作1：4～1：9共6组稀释，调pH至5.0，4℃冰箱过夜，测定上清液中脂肪含量，计算除脂率。

1.2.6.2 酸化水pH对除脂率的影响

每组取10个鸡蛋卵黄液，分别用0.12 mol·L-1醋酸盐缓冲液作1：8稀释，调pH至4.8、5.0、5.2、5.4共4组，4℃冰箱过夜，测定上清液中脂肪含量，计算除脂率。

1.2.6.3 酸化水作用时间对除脂率的影响

每组取10个鸡蛋的卵黄液，分别用0.12 mol·L-1醋酸盐缓冲液作1：8稀释，调pH至5.2，置于4℃冰箱内5、8、12、15 h，测定上清液中脂肪含量，计算除脂率。

1.2.6.4 离心条件对除脂率的影响

每组取10个鸡蛋卵黄液，分别用0.12 mol·L-1醋酸盐缓冲液作1：8稀释，调pH至5.2，置于4℃冰箱内15 h（过夜），1 900 g离心20、30 min；7 598 g离心20、30 min；空白作对照；测定上清液中脂肪含量，计算除脂率。

1.2.7 除脂条件对IgY提取的影响

将上述除脂主要影响因素，在相同条件下经辛酸和硫酸铵作用，提取IgY，测定其效价、蛋白浓度及蛋白质纯度等，观察不同除脂条件对IgY提取的影响。

1.2.8 脱脂条件优化参数组合试验

取600枚高免鸡蛋，分6个批次，按上述试验确定最优参数组合作脱脂工艺试验，提取上清液，测定脂肪含量，计算除脂率、琼扩效价、蛋白浓度。

1.3 统计与分析

使用Excel 2007、SPSS 16.0软件作多重比较，平均值±标准差（Mean±SD）表示。结果数据列表中，同列肩标大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01）；小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）；字母相同表示差异不显著（P＞0.05）。

2 结果与分析

2.1 除脂主要影响因素

2.1.1 酸化水稀释度对除脂率的影响

比较6组不同酸化水稀释度，根据颜色、澄清度、沉淀状态及除脂率评价条件，随稀释倍数增加，上清液澄清，卵黄沉淀逐渐结实，稀释度为1：8时，除脂率达96%以上，均一、稳定，除脂率最高。结果如表1、图2所示。

表1 酸化水稀释度对除脂率的影响Table 1 Effect of acidified water dilution on lipids removal rate

2.1.2 酸化水pH对除脂率的影响

比较4组不同酸化水pH，根据颜色、澄清度、沉淀状态及除脂率评价条件，pH为4.8时，几乎无沉淀且浑浊，随pH增大，上清液澄清，沉淀逐渐结实，呈胶质状，当pH至5.2时，除脂率达96%以上。结果见表2。

图2 酸化水稀释度对除脂率的影响Fig.2 Effect of acidified water dilution on degreasing rate

表2 酸化水pH对除脂率的影响Table 2 Effect of acified water pH on degreasing rate

2.1.3 酸化水作用时间对除脂率的影响

4℃作用5、8、12、15 h，除脂率无明显差异，均达96%以上，但卵黄沉淀随着作用时间增加，沉淀密度增加且无流动性，倾倒未随上清液流出，结合规模化生产15 h为最优时间。结果如表3所示。

表3 酸化水作用时间对除脂率的影响Table 3 Effect of action time of acidified water on degreasing rate

2.1.4 离心条件对除脂率的影响

比较上清液未离心、离心力1 900 g、7 598 g，在不同离心时间下除脂率，无明显差异，其中以离心力1 900 g，20 min除脂率最高，达96.91%，结果如表4所示。

2.2 除脂条件对IgY提取的影响

2.2.1 酸化水稀释度对IgY提取的影响

不同稀释度水脱脂后，经辛酸和硫酸铵作用，提取IgY作琼脂扩散试验，测定AGP，效价值为64、128倍。蛋白质含量和纯度存在差异，稀释度1：5和1：8组蛋白质含量与其他组存在差异，提取IgY含量高，但1：5稀释度AGP效价比1：8低，稀释度1：8时为最优稀释度。结果见表5、图3。

2.2.2 酸化水pH对IgY提取的影响

卵黄液经不同pH脱脂后，测定提取IgY琼扩效价，达到64、128倍。随pH升高蛋白质纯度增高，但差异不显著，pH 5.2时蛋白浓度略高，为最优pH，结果见表6、图4。

2.2.3 酸化水作用时间对IgY提取的影响

四种时间作用脱脂后，测定提取IgY琼扩效价，达到64、128倍，蛋白质含量5 h为19.79 mg·mL-1、8 h为20.90 mg· mL-1、12 h为20.10 mg· mL-1、15 h为20.16 mg·mL-1，差异不显著，结果见表7。

2.2.4 离心条件对IgY提取的影响

取鸡卵黄，用醋酸盐缓冲液1：8稀释后，调pH5.2，置4℃过夜，取200mL卵黄液经不同离心条件脱脂后，提取IgY，结果显示离心力为1900g，离心20 min时，提取数量最多，且蛋白浓度最高，琼扩效价无差异。结果见表8。

表4 离心条件对除脂率的影响Table 4 Effects of centrifugal conditions on degreasing rate

表5 酸化水稀释度对IgY提取的影响Table 5 Effect of acidified water dilution on IgY extraction

图3 酸化水稀释度对提取IgY影响电泳Fig.3 Electrophoresis image of the effect of acidified water dilution on the extraction of IgY

2.3 脱脂条件优化参数组合试验验证

取600枚高免鸡蛋，分为6个批次，按上述试验确定最优参数组合，酸化水1：8稀释、pH 5.2、4℃存放15 h，1 900 g离心20 min作脱脂试验，结果显示琼扩效价均达1：64以上，蛋白浓度达19 mg·mL-1以上，除脂率超过96%。结果见表9。

表6 酸化水pH对IgY提取的影响Table 6 Effect of acified water pH on IgY extraction

图4 酸化水pH对IgY提取的影响电泳Fig.4 Electrophoresis image of the effect of pH of acified water on IgY extraction

表7 酸化水作用时间对IgY提取的影响Table 7 Effect of storage time of acidified water on IgY extraction

表8 离心条件对IgY提取的影响Table 8 Effect of centrifugal conditions on IgY extractionn

表9 脱脂条件优化参数组合试验Table 9 Combination test of skim condition optimization parameters

3 讨论与结论

3.1 除脂主要影响因素

卵黄脱脂研究国外起步较早、相对成熟，如PEG法及其改进方法（1980和1985）、氯仿-PEG法（1984）、硫酸葡聚糖法（1981）和水稀释法等[16]。国内研究中，柴家前提出甲醛脱脂法，添加0.3%～1.2%甲醛溶液[17]；常维山提出苯酚脱脂法，采用2%～3%纯苯酚溶液[18]；王辉龙等研究聚乙二醇一步沉淀提取法[19]；杨严俊等利用高分子胶结合超滤技术[20]。以上方法普遍存在成本高、产量低、抗体纯度低、效价低等缺点，小鹅瘟抗体使用效果较差。本试验运用相似相溶原理，探讨稀释度、酸碱度、存放时间和离心条件4个因素对卵黄除脂的影响。将卵黄混匀于水中，使脂蛋白聚集沉淀或离心分离，获得含IgY上清液。醋酸盐缓冲液作1：4～1：9稀释卵黄，共6个稀释度，调pH 5.2，置于4℃冰箱内15 h。上清液颜色由黄逐渐转变为乳白色，由浊变清，上清液增多，沉淀部分密实。1：7以上的3个稀释度除脂率可达96%以上，本研究增加1：4、1：9两组试验，差异显著，说明醋酸盐缓冲液稀释倍数对除脂率影响显著，其中1：8稀释度除脂效果最佳，且IgY含量与琼扩效价最理想，因此作为酸化水除脂的稀释度。

用水稀释卵黄后，稀释液pH显著影响除脂和IgY提取效果。pH 4.8时，上清液浑浊，沉淀松散，随pH升高，上清液逐渐澄清，沉淀密实，呈胶体状，除脂率升高。当pH升至5.2时，除脂率达96%以上。Akita等研究表明，酸度影响卵黄浆液中脂类含量，pH 4.6～5.2时，水溶液中几乎无脂类物质，pH继续增加，水溶性脂类含量增加，可能是酸度升高影响脂肪去除[21]。为此，将卵黄液pH调至5.2，除脂率和IgY提取效果较好。

卵黄液1：8稀释后，pH 5.2，不同时间除脂效果基本相同，存放5 h除脂率较大，在工厂化前提下，考虑大量提取的实际情况，选用存放15 h（过夜），沉淀较密实且呈胶体状，保证除脂效果。

以酸化水除脂时，卵黄作1：8稀释，pH 5.2，经15 h作用后，上清液较为澄清，脂蛋白沉淀密实。比较离心力1 900 g、7 598 g与未离心处理，未离心上清液量较少，除脂率略低。为此，在保证除脂效果及IgY提取量、纯度情况下，采用1 900 g离心20 min方法，但工业化生产中对离心设备容量、安全性、电力及人工成本要求较高，未来将进一步考虑调整工艺参数，达到工业化标准。酸化水具有操作简便、成本低廉、除脂效果好等优点，但提取液中仍有脂类与蛋白结合，存在微量非目的蛋白，提高提取IgY纯度尚待深入研究。

3.2 除脂条件对IgY提取质量的影响因素分析

氯仿、苯酚、辛酸等有机溶剂抽提沉淀法及Kim与Hatta等利用非离子型表面活性剂原理[7-8]，使卵黄脂类互相凝结，发生沉淀，实现脂水分离。但浓度过高时，破坏抗体蛋白水化膜使之发生沉淀，影响抗体效价[9-10]。本试验中稀释度、酸碱度、存放时间和离心条件4个因素是制约去除IgY中脂类重要因素。在稀释度试验中，琼扩效价及蛋白浓度呈先升后降趋势，虽然1：6、1：7、1：8稀释度蛋白含量较高，结合除脂率影响故选择1：8稀释倍数，但酸化水稀释度对提取IgY影响的电泳图中可见其他条带，说明存在杂蛋白，应考虑进一步去除。

在酸化水pH对IgY提取的影响试验中，pH 5.2可得到较高蛋白含量，但电泳图上可观察鸡免疫球蛋白分子质量67 ku左右重链、分子质量为22 ku左右轻链和分子质量为45 ku、35 ku电泳条带，为杂蛋白条带。蛋白含量高可由杂蛋白引起，需进一步提纯分析。酸化水作用时间对IgY提取试验中各组琼脂扩散效价及蛋白浓度并无显著差异，结合除脂率及工业化生产需要，选择人力、电力较为经济的15 h（过夜）工艺方法，方便生产转化。酸化水离心条件对IgY提取试验中，未离心试验组获得目的蛋白含量较低，可能是无外力作用下目的蛋白较少，但此方法对设备、人力要求不高，琼脂扩散效价无差异，但获得IgY纯度略低。因此，考虑除脂工艺时应结合除脂率综合评定蛋白含量及琼脂扩散效价。