血清miR-374a在宫颈癌患者中的表达变化及其与临床病理特征的关系

亓颖芝,郎晓艳,周静,李春凤,李静,芦鑫

(山东大学第二医院,济南250033)

宫颈癌是一种女性常见恶性肿瘤[1]。近年，我国宫颈癌发病率和病死率明显上升。miRNA是一类大小为18～25个核苷酸的非编码单链RNA，通过与mRNA的非编码区3′UTR相互结合，来发挥对靶mRNA的降解或抑制其翻译[2]，其广泛分布于血清、尿液、脑脊液等体液中，且稳定存在。有文献[3]报道，miR-374a在结肠癌中表达水平较癌旁组织明显上调[4]；其在非小细胞肺癌中的表达也明显升高；Cai等[5]发现，miR-374a可以激活Wnt/β-catenin分子通路，进而促进乳腺癌的侵袭转移。因此，推测miR-374a可能在肿瘤发生发展中发挥重要作用。但是目前关于miR-374a表达水平与宫颈癌患者临床病理特征的相关性尚未见报道，本研究进行了相关探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年8月～2017年4月入住山东大学第二医院妇科拟手术治疗的宫颈癌患者68例，均经病理检查确诊。术前均未行化疗、放疗等其他治疗。年龄33～65岁。病理分级：G1级20例、G2级33例、G3级15例；临床分期按国际妇产科联盟分期标准:Ⅰ期30例、Ⅱ期38例；组织类型：鳞癌40例、腺癌28例；有淋巴结转移23例，无45例；根据是否感染人类乳头瘤病毒(HPV)划分:阳性50例，阴性18例;肿瘤直径≥4 cm 23例，<4 cm 45例。选取体检健康者36例作为对照组，年龄35～60岁。无宫颈部位的病变或者癌症史。所有血液标本收集后置于-80 ℃低温保存。

1.2 血清miR-374a的检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应(QRT-PCR)法。提取RNA：术前抽取宫颈癌患者静脉血，总RNA于患者和正常体检者血清中提取，提取方法按照天根miRcute miRNA提取分离试剂盒说明书操作。提取后使用紫外分光光度仪检测样品的浓度与纯度，进行后续试验。合成cDNA：按照First Strand cDNA Synthesis Kit说明书加入反转录反应所需要的各种试剂，将总RNA进行逆转录合成cDNA。反应条件如下:16 ℃、15 min, 40 ℃、45 min,85 ℃、15 s。QRT-PCR：以逆转录产物为模板，按照SYBR Premix EX TaqTM试剂盒说明书操作，20 μL反应体系中加入miR-374a引物，在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，其反应条件为:预变性95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35个循环。U6-上游引物： 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′;U6-下游引物：5 ′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。MiR-374a-上游引物：5 ′-TTATAATACAACCTGATAAGTG-3′；MiR-374a-下游引物： 5 ′-TGTCAACGATACGCTACGTAA-3′。采用相对定量方法对miRNA进行相对表达量计算，U6作为内参，以2-ΔΔCT法计算宫颈癌患者及健康对照者血清miR-374a表达水平。

2 结果

2.1 两组血清中miR-374a的表达水平比较 宫颈癌组与对照组血清miR-374a相对表达水平分别为2.89±0.91、1.01±0.23。与对照组相比，宫颈癌组血清miR-374a表达水平升高(P<0.05)。

2.2 血清miR-374a表达水平与宫颈癌患者临床病理特征的关系 宫颈癌患者血清miR-374a表达水平与临床分期、病理分级、是否存在淋巴结转移密切相关(P均<0.05)；与患者年龄、宫颈癌组织学类型、是否HPV感染、肿瘤直径无关(P均>0.05)。见表2。

表2 血清miR-374a表达水平与宫颈癌患者临床病理特征的关系

3 讨论

宫颈癌是最常见妇科恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中发病率居第二位[6]。因此从分子水平对宫颈癌发病机制进行深入研究有助于发现新诊疗方法，提高宫颈癌的疗效。宫颈癌患者血清中循环miRNA的表达谱与正常健康对照者相比有一定的差异，并且循环miRNA在血清中稳定且不易降解，有可能成为宫颈癌早期筛查及诊断的无创标志物。循环miRNA是胞外分泌的膜包裹颗粒非编码小RNA，可以与蛋白质结合，也可以游离存在[7]。Nagamitsu等[8]研究宫颈癌患者血清中的miRNA，找出6个与正常对照组相比表达差异明显的miRNA，进一步试验后得出miR-483-5p、miR-1246、miR-1275和miR-1290可作为宫颈癌的诊断标记物。Wang等[9]发现，宫颈癌患者血清中miR-646、miR-141和miR-542-3p在手术前后表达有差异，推测这些miRNAs可成为宫颈癌术后复发监测的新指标。Jia等[10]同样检测宫颈癌患者和正常对照组血清中循环miRNA的表达水平，得出宫颈癌组有12个miRNA的表达量明显升高。其中5种miRNA联合检测宫颈癌的特异性和灵敏度高于鳞状细胞癌抗原(SCC)和CA125，推断相对于SCC和CA125，血清中miRNAs诊断宫颈癌更有优势。因此循环miRNAs可成为宫颈癌早期无创诊断的新肿瘤标志物，甚至有可能取代传统非特异性的SCC和CA125等血清标志物。

miR-374a是位于X染色体上q13的miRNA。近年很多研究证实，miR-374a在许多肿瘤，如胃癌、肺癌、乳腺癌、胶质瘤中表达异常，并参与肿瘤的侵袭和转移，发挥重要的基因调控作用。目前miR-374a在宫颈癌患者血清中的表达尚不清楚。本研究结果显示，与对照组比较，宫颈癌组miR-374a表达水平升高，推测其可能参与宫颈癌的发生、发展。miR-374a有可能成为宫颈癌早期筛查及诊断的新标志物。

Xu等[11]研究发现，胃癌组织中miR-374a表达水平明显升高，miR-374a可以促进胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力，该研究还得出miR-374a通过靶向C激酶信号抑制剂1而发挥作用。Cai等[5]研究发现，miR-374a在乳腺癌转移细胞株中通过靶向WIF1、PTEN、WNT5A，激活Wnt/β-catenin信号，促进乳腺癌细胞上皮细胞间充质转化和转移；而且miR-374a在发生远处转移的乳腺癌患者中表达水平明显升高，并与生存率密切相关，提示miR-374a在乳腺癌侵袭、转移过程中发挥了重要作用。

本研究首次检测了宫颈癌患者血清中miR-374a的表达水平，并进一步分析了miR-374a与宫颈癌患者各临床病理特征之间的关系，miR-374a在宫颈癌不同临床分期中的表达水平的差异有统计学意义，Ⅱ期患者血清中miR-374a的表达水平高于Ⅰ期患者；在有淋巴结转移患者的相对表达水平高于无淋巴结转移患者，G2～G3级宫颈癌患者中miR-374a的表达水平高于G1级患者，提示miR-374a可能为一种新的肿瘤标志物，并且miR-374a血清水平的高低可能有助于鉴别癌症患者的临床分期、病理分级、是否存在淋巴结转移。由此推测miR-374a可能促进肿瘤细胞生长，与肿瘤促进因子作用相似。但是miR-374a在调控宫颈癌发生发展中具体分子机制仍不清楚，miR-374a调控靶基因信号通路有待于进一步研究。