地奥司明预处理对新西兰白兔移植供心的保护作用

郑兴,吴兆红,黄达德,陈敏东,谢建将,白文杰

(1广州医科大学附属第三医院,广州510150;2广州市第一人民医院)

心脏移植是心脏衰竭最有效的治疗方法之一，供心心肌保护是手术成功的关键也是当前研究热点。科技进步为供心保护提供了多种方法，1987年Grobben等[1]开始用含氧或含血停搏液保护供心细胞。Eltzschig等[2]提出远端缺血预处理概念并用以保护靶器官缺血再灌注损伤。2005年欧美多家心脏中心开展供心不停跳保存保护移植供心。众多供心保护方法中，药物预处理可控性和安全性较高。许多研究发现药物预处理在抗心肌缺血再灌注损伤方面有良好效果，具有良好临床应用前景。已经证实预处理对移植供心有保护作用的药物有单磷酰酯A、三磷酸腺苷敏感性钾通道开放剂(KATPCOs)、吸入性麻药和阿片类麻醉药、腺苷等。地奥司明具有清除自由基、抗脂质及舒张血管作用[3，4]，其预处理已被证实对肾、脑等器官缺血再灌注损伤有保护作用，但未见对心脏移植中供心保护作用的报道。2016年1～12月，我们以新西兰白兔为实验动物，建立对照组、地奥司明预处理组和地奥司明加超氧化物歧化酶(SOD)抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDTC)预处理组，对比各组心肌酶、凋亡指数、心肌组织含水量，并观察镜下心肌组织，探讨地奥司明预处理对移植供心的保护作用及其机制，为地奥司明预处理的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 成年健康新西兰白兔36只，雌雄不限，体质量(2.5±0.5)kg，实验动物由广东省实验动物中心提供，在广州市第一人民医院动物实验中心统一饲养。主要试剂和仪器： DDTC溶液(西格玛奥德里奇公司，按1 g DDTC溶于10 mL生理盐水配制)，TUNEL试剂盒(promega公司)，起搏器(5348型，美国Medtronic)，血气分析仪(i-stati型，美国Abbott)，光学显微镜(CX41，日本Olympus)，小动物呼吸机(江西特力公司)，除颤及心电监护仪(LD-9型，美国PHYSIO-CONTROL)，生物组织石蜡包埋机(武汉俊杰电子公司)，组织切片机(Shandon)，图像分析系统(重庆天海医疗设备有限公司)，自动生化分析仪(Cobas 6000，美国罗氏)，磷酸肌酸同工酶MB检测试剂盒、高敏肌钙蛋白T检测试剂盒、肌红蛋白检测试剂盒(美国罗氏)。

1.2 供心摘取 供体兔称重，腹腔注射50 mg/kg苯巴比妥钠,麻醉成功后，行气管切开插管，插管深度3 cm，接小动物呼吸机(参数设置：容量控制、氧浓度40%～50%、潮气量8 ml/kg、呼吸频率23次/min)。正中开胸，游离心脏大血管，右房全身肝素化(400 U/kg),阻断主动脉并灌注改良Stanford停搏液(15 mL/kg，4 ℃),灌注完毕后取心，结扎修剪心脏血管，置于改良Stanford停搏液中(4 ℃)保存2 h。

1.3 分组及处理 实验动物随机抽样分为对照组、地奥司明预处理组、地奥司明+DDCT预处理组，每组12只。各组内再次随机抽样分为6亚组，组内随机分配抽出供体、受体。分组结果：对照组(n=12，供体、受体各6只)；地奥司明预处理组(n=12，供体、受体各6只)；地奥司明+DDTC预处理组(n=12，供体、受体各6只)。对照组正常饮食。地奥司明预处理组在实验开始前10 d予以地奥司明(80 mg/kg)灌胃，2次/d。地奥司明+DDCT预处理组在实验开始前10 d予以地奥司明(80 mg/kg)灌胃，2次/d，并在行同种异位心移植前15 min，于兔耳缘静注射DDTC(300 mg/kg)。受体麻醉、气管插管同供体。建立耳缘静脉补液通道，耳缘静脉采血2 mL送检。然后行改良Ono’s异位心移植术(股动静脉处行同种异位心脏移植术)。具体操作：受体右侧腹股沟中点做长4 cm切口，显露并游离股动、静脉；修剪医用输液管道(保留转换接头部分)，管道段分别插入并结扎固定于已修剪完成的供心主动脉和肺动脉端；留置针(BD公司，24 G)插入受体股动、静脉，并用7号线打结固定；取出供心并充分挤压供心排尽左心室气体，开放股动脉血管钳，将主动脉转换接头与股动脉留置针衔接，并旋转固定，肺动脉转换接头与股静脉留置针衔接并旋转固定。心脏复跳30、60、90 min于耳缘静脉通道处采血2 mL送检，心脏复跳2 h后取下供心结束实验。

1.4 心肌细胞结构的观察 实验结束后立刻在移植供心左心室纵轴取厚约2 mm的心肌组织，对标本进行石蜡包埋、切片、脱蜡至水、染色、脱水及透明处理、封片后，光镜下观察供心心肌细胞结构。同样取材方式取心肌组织标本，立刻置于4 ℃、2.5%戊二醛中进行固定操作，然后50%～100%乙醇多级脱水，后用环氧树脂进行包埋，超薄切片和醋酸铀染色，透射电镜观察。

1.5 心肌酶指标的检测 受体新西兰兔移植前，移植后30、60、90 min，分别于耳缘静脉补液通路采静脉血2 mL，低温保存，2 h内使用本院全自动血液生化仪测定肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(MYO)。

1.6 供心左室心肌组织含水量检测 供心移植并成功复跳后2 h，取下供心，在供心左心室心尖部用眼科剪剪取部分心肌组织，试纸拭干心肌组织标本表面水分，称取心肌组织标本湿重并记录。然后将心肌组织标本放置于电热恒温鼓风干燥箱里，65 ℃恒温干燥24 h，最后称取心肌组织标本干重并记录。按心肌组织含水量计算公式[含水量=(心肌组织湿质量-干质量)÷心肌组织湿质量×100%]计算心肌组织含水量。

1.7 心肌细胞凋亡指数(AI)检测 用光学显微镜观察标本。细胞核中存在褐色颗粒物的为凋亡心肌细胞。每份标本观察3张切片，每个切片随机选择5个视野计数，在400倍显光学微镜下计算标本切片的凋亡心肌细胞和正常心肌细胞个数。AI=凋亡细胞数/总细胞数。

2 结果

2.1 各组肉眼观察结果 本实验研究进行移植手术19例，失败1例，改良Ono’s模型建立成功率94.74%，移植吻合用时(5±2)min。失败实验受体尸体解剖可见气管黏膜大片斑片样出血灶，考虑致死原因为呼吸道出血引起气道梗阻。移植供心自动复跳，窦性心律，心率110～150次/min，收缩力良好。供心肉眼观察：地奥司明预处理组较对照组、地奥司明+DDCT预处理组心肌收缩更有力，节律更好，心肌更红润；对照组和地奥司明+DDCT预处理组无明显区别。移植供心心功能复灌后半小时达最佳，实验结束时，心功能均有不同程度下降，具体表现为心脏收缩乏力和心律不齐，其中对照组和地奥司明+DDCT预处理组尤为明显。

2.2 各组心肌酶比较 移植前各组基础心肌酶指标差异无统计学意义(P均>0.05)。复跳后30、60、90 min三组心肌酶指标均升高。地奥司明预处理组心肌酶指标升高幅度均低于另外两组(P均<0.05)；地奥司明+DDTC预处理组心肌酶指标升高幅度低于对照组，但差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

2.3 三组左室心肌组织含水量比较 对照组、地奥司明预处理组、地奥司明预处理+DDCT组左室心肌组织含水量分别为80.8%±1.1%、72.7%±1.5%、79.7%±1.1%，地奥司明预处理组较对照组和地奥司明预处理+DDCT组低(P均<0.01)。地奥司明预处理+DDCT组与对照组比较，P>0.05。

2.4 三组镜下表现 ①光镜下观察：地奥司明预处理组：心肌细胞染色良好，形态接近正常，排列规则有序，心肌纤维丰富，间隙和结构基本正常，细胞核蓝染、大小形态近正常，胞质呈淡红染，形态饱满。地奥司明+DDTC预处理组：心肌细胞排列欠规则，结构欠清晰，心肌细胞稍显肥大，横纹结构欠清晰，心肌纤维结构稍紊乱、间隙扩大，纤维淡染模糊，心肌间质出现水肿，部分心肌细胞出现变性和不同程度坏死，细胞核溶解、固缩和消失。对照组：心肌细胞普遍呈变性和坏死，细胞结构和排列秩序紊乱，细胞间隙增大且界限模糊，大部分细胞核固缩，个别溶解、消失，胞质溶解呈空泡气球样变或网状改变。②电镜下观察：地奥司明预处理组：心肌细胞核大致呈三种形态：梭形、椭圆形、长杆状，核膜清晰可见，常染色体为细颗粒状，异染色体分布在核膜内侧，肌纤维排列未见紊乱，闰盘、Z带清晰可见，肌原纤维间有杆状线粒体和糖原颗粒。线粒体排列均匀，线粒体脊和膜清晰可见，L小管存在两侧肌浆网；地奥司明+DDTC预处理组：细胞核不规则形，核膜尚且清晰，肌纤维排列接近正常，闰盘、Z带较模糊，线粒体轻微肿胀，部分出现嵴溶解，糖原颗粒减少；对照组：细胞核呈不规则形，肌纤维排列紊乱，闰盘、Z带模糊，线粒体较肿胀，嵴溶解，糖原颗粒显著减少。

表1 三组不同时间cTnI、CK-MB、肌红蛋白比较

2.5 三组心肌细胞凋亡指数比较 对照组、地奥司明预处理组、地奥司明预处理+DDCT组心肌细胞凋亡指数分别为21.6%±1.3%、7.1%±0.9%、20.3%±1.4%。地奥司明预处理组较对照组和地奥司明预处理+DDCT组低(P均<0.01)；地奥司明+DDCT预处理组凋亡指数虽然较对照组低，但组间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

啮齿类动物异位心脏模型[5]是研究心脏移植的最佳模型并且应用广泛。Yildiz等[6]利用小鼠成功进行腹腔异位心移植术(Ono’s术式)，Steurer等[7]用颈部动静脉完成了小鼠同种异位心移植。腹腔异位心移植模型吻合成功率高、移植供心血供充足，但相对颈部异位心移植模型而言，腹腔异位心移植模型创伤更大、对受体内环境影响更显著且移植供心观察不方便。我们在Ono’s术式基础上对动物模型进行改良，将移植位置从腹腔动静脉改至股动静脉，使用动脉留置针套管插管吻合术式，减少受体创伤同时保证供心的吻合成功率和血运。改良Ono’s心脏移植模型具有手术操作简便，用时短，成功率高，创伤小，对动物生理影响小等优点，是最适合研究心脏移植的模型之一，尤其适用于吻合技术不成熟、样本量大的实验。本研究采用改良Ono’s心脏移植模型实验方法，设立对照组、地奥司明预处组、地奥司明+DDCT预处理组，对心脏移植后各组间心肌酶、凋亡指数、心肌含水量、心肌组织进行对比分析，进行地奥司明预处理对移植供心的保护作用及保护机理的研究。

地奥司明为天然黄酮类衍生物，具有促进静脉回流和保护血管作用，主要用于痔疮及慢性静脉功能不全疾病治疗。近年研究发现，地奥司明预处理具有减少细胞凋亡、抑制炎症反应、降低氧化应激反应、增高SOD活性等作用[8～10]，对减轻器官缺血再灌注损伤有明确作用。Xiong等[11]研究发现，地奥司明预处理可抑制机体炎症反应，减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。袁铭等[12]发现，地奥司明预处理可提高大鼠体内SOD活性，减轻肾脏缺血再灌注损伤。本研究发现，地奥司明预处理能减轻移植供心心肌水肿和凋亡坏死，并降低移植后受体心肌酶指标，表明地奥司明预处理对移植供心有保护作用。为探明地奥司明对移植供心保护作用机制，我们建立地奥司明+DDCT预处理组，在供心移植前15 min于受体耳缘静脉注射SOD抑制剂DDTC，实验结果得出地奥司明+DDCT预处理组移植供心心肌含水量、心肌细胞凋亡指数和移植后受体心肌酶指标较地奥司明预处理组高，与对照组相比并无明显差异，表明地奥司明预处理通过提高机体抗氧自由基作用达到减轻心肌细胞损伤目的，起保护心肌作用。

我们通过实验，一方面，证实了在抗心肌缺血再灌注损伤方面地奥司明预处理有较好效果，主要通过提高体内SOD活性来实现，与学者们早期研究结果相符合；另一方面，扩大了预处理使用的选择范围,并为药物预处理在临床应用奠定动物实验基础。但是，实验样本含量较小是本实验不足之处，接下来我们将进行更大样本实验研究来验证实验结果。

综上所述，本实验证实了改良Ono’s心脏移植模型有效、成功率高，可广泛应用于动物心脏移植实验中。地奥司明预处理能降低心脏移植中心肌缺血再灌注损伤，主要是通过提高机体抗氧化作用实现，在临床应用中具有广泛前景。