副溶血弧菌TDH对大黄鱼的免疫保护效果

张赛乐 闫茂仓 王瑶华 陈然 （浙江海洋水产养殖研究所 浙江 温州 325005）



副溶血弧菌TDH对大黄鱼的免疫保护效果

张赛乐 闫茂仓*王瑶华 陈然 （浙江海洋水产养殖研究所 浙江 温州 325005）

本试验以大黄鱼为研究对象，探讨副溶血弧菌TDH对其免疫保护效果。设VPtdh注射免疫处理组和PBS注射对照组，每组做3个重复。免疫处理组每尾鱼腹腔注射0.1ml接种2mg/ml VPtdh，对照组注射相同剂量的灭菌生理盐水，每组鱼接种100尾。试验前和免疫注射第7、14、21和28天，测定抗体水平和相对免疫保护率。结果表明，接种VPtdh后抗体水平较对照组有显著提高，在21d达到峰值；免疫28d后，相对免疫保护率达70.4%。证实副溶血弧菌TDH对大黄鱼有较好的免疫保护效果。

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)是我国重要的网箱养殖经济鱼类之一，目前日益严重的病害阻碍了大黄鱼养殖业的可持续发展，其中尤以弧菌(Vibrio sp.)引起的败血症和肠炎等对规模化养殖构成较大威胁，弧菌病具有发病率高、稚鱼死亡率高、发病季节长、传播速度快等特点，主要致病弧菌包括副溶血弧菌(V. Parahaemolyticus)、哈氏弧菌(V. harveyi)、鳗弧菌(V. anguillarum)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)和创伤弧菌(V. vulnificus)[1-3]。其中，副溶血弧菌是目前在海水鱼类养殖中有极大危害的病原弧菌之一，业已证实，副溶血弧菌可感染大黄鱼，感染后表现为肠道炎症，皮肤溃烂，烂尾，眼球、下领、鳍基部、肌肉充血等症状[3-6]。副溶血弧菌具有很多毒力因子参与其致病过程，包括溶血素、黏附因子、各种酶以及细菌分泌系统等。其中耐热直接溶血毒素(thermostable direct hemolysin，TDH)与副溶血弧菌致病性密切相关，是公认的主要毒力因子，具有溶血性、细胞毒性和肠毒性[7-9]。同时，TDH也具有较好免疫原性和免疫效果。本研究拟进行大黄鱼副溶血弧菌tdh基因的克隆表达，制备TDH蛋白，免疫接种评价副溶血弧菌VPtdh对大黄鱼的免疫保护效果，为大黄鱼副溶血弧菌的防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试鱼 浙江省海洋水产养殖研究所自繁养殖大黄鱼，体重(41.3±3.71)g；选择规格一致、外观健壮、游动活泼、无外伤的鱼作为试验鱼。试验鱼暂养于5m×8m×1.0m的室内水泥池中，充气，以配合饵料(福州海马饲料有限公司)每日早、晚各投饵1次，每天上午换水70%，流水3h，水温控制在27.8~31.2℃。暂养2周后，进行免疫接种。

1.2 菌株 副溶血弧菌大黄鱼分离株，由本实验室从乐清湾患病养殖黄鱼中分离保存。Rosetta(DE3)菌株购自上海生物工程有限公司。

1.3 副溶血弧菌TDH蛋白的制备

1.3.1 引物设计 根据GenBank副溶血弧菌tdh基因的DNA序列，应用Premier5.0软件设计引物：F：5’-GCGG ATCCATGAAACACCAATATTTTGC-3’(含BamHI酶切位点)；R：5’-CGGAATTCTTATTTTTATTGTTGATGT-3’(含EcoRI酶切位点)。

1.3.2 PCR检测 提取大黄鱼副溶血弧菌基因组DNA，PCR扩增tdh基因片段。反应程序：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，重复35个循环，72℃保持10min。产物用1g/d·L琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.3.3 重组pET28b-TDH质粒构建 将载体pET-28b分用限制性内切酶(BamHI 和EcoRI)进行酶切，用T4-DNA连接酶与目的片段在16 ℃过夜连接。

1.3.4 诱导表达融合蛋白 取1µl重组的pET28b质粒转化Rosetta(DE3)菌株，42℃热击90s，冰上静置2min后涂平板(30µg/ml卡那霉素和34µg/ml氯霉素)，37℃恒温箱培养过夜。扩大培养接种于4L的LB液体培养基中，添加30µg/ml卡那霉素和34µg/ml氯霉素，37℃，220rpm培养约3h，当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mM IPTG，20℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体。将收集的细菌菌体用破碎溶解，冰浴中超声破碎菌体，12000rpm，4℃，离心20min，上清进行镍琼脂糖亲和层析，将收集到的组分进行SDS-PAGE检测后，将纯度最好的组分透析至1XPBS，pH7.4中，0.45μm滤膜过滤浓缩分装，-80℃保存。

1.3.5 纯化蛋白的检测 SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白，采用SK3071 非干扰型蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量。调整使用浓度为2 mg/ml备用。

1.4 试验分组

试验在3.3m×3.3m×1.0m的水泥池中进行。设VPtdh注射免疫处理组和PBS注射对照组。每组做3个重复。免疫处理组每尾鱼腹腔注射0.1ml接种2mg/ml VPtdh，对照组注射相同剂量的灭菌生理盐水，每组鱼接种100尾。试验前和免疫注射第7、14、21和28d后，分别从每组中随机捞取5尾鱼尾静脉采血，制备血清，供检测抗体水平。

1.5 抗体水平的测定

采用间接ELISA的方法测定血清中抗体水平，一抗为待测血清(即-20℃冷冻保存的样品)，二抗为实验室自制的兔抗大黄鱼IgM多克隆抗体，三抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(SIGMA)。抗原浓度1×108cfu/ml，包被4℃过夜；酶标抗体浓度为1:20000；底物作用20min后，终止液终止，测OD450值。

1.6 免疫保护率测定

采用Reed and Muench(1938)的方法测定副溶血弧菌对大黄鱼的LD50分别为5.2×105cells/鱼。于免疫接种后的第28 d，从免疫处理组和对照组各取30尾大黄鱼，每组各设3个平行组，每个平行组10尾鱼，每尾鱼腹腔注射0.1ml浓度为5.2×106CFU/ml副溶血弧菌活菌液。置于二级沙滤水饲养，连续观察14d，记录死亡状况，并进行解剖和病原的再分离以确定是否死于攻毒活菌引起的感染。试验结束后计算相对免疫保护率：

1.7 数据处理

采用STATISTICA.0统计软件作单因素方差分析处理，组间差异采用Duncan’s多重比较，显著水平为0.05，极显著水平为0.01。

2 结果与分析

2.1 副溶血弧菌TDH蛋白的制备

SDS-PAGE分析结果提示，基因重组的TDH蛋白表达成功。经检测在23KD处出现重组蛋白条带与目的条带相符。经不同浓度咪唑洗脱后，洗脱液中含有目的蛋白(图1)。融合蛋白经过纯化，SDS-PAGE电泳分析在相应位置出现明显条带，表明融合蛋白成功得到了纯化(图2)。Western Blot验证在相应位置出现明显条带(图3)。用SK3071非干扰型蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白，以BSA为标准物质制定标准曲线，测定融合蛋白浓度为2.395mg/ml。

图1 镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE电泳图

M：Protein marker；1：上样；2：流出；3-5：20mM Imidazole洗脱组分；6-7：50mM Imidazole洗脱组分；8：100mM Imidazole洗脱组分；9-11：500mM Imidazole洗脱组分。

图2 目的蛋白纯化SDS-PAGE电泳图

M：Protein marker；1：目的蛋白。

图3 蛋白Western Blot结果

M：Protein marker；1：目的蛋白。

2.2 接种VPtdh对大黄鱼血清中抗体产生的影响

经VPtdh腹腔注射免疫后，大黄鱼血清中抗体水平的产生规律(如图4)。对照组OD450在0.140~0.173，在28d的实验期间无显著差异(P>0.05)。腹腔注射VPtdh后大黄鱼血清中抗体水平迅速提高，免疫3d后，实验组血清中抗体水平高于对照组水平(P<0.05)；在试验的第7d，各实验组抗体水平显著高于对照组水平，直到第28d，一直保持高水平值，抗体水平在第21d时达到最高水平。

图4 VPtdh对大黄鱼血清中抗体产生的影响

2.3 相对免疫保护率

接种VPtdh 28d后，分别测定大黄鱼对副溶血弧菌的相对免疫保护率(附表)。结果表明，VPtdh可提高大黄鱼抵抗副溶血弧菌的能力。

附表 VPtdh大黄鱼对副溶血弧菌的相对免疫保护率比较（%）

组别攻毒鱼尾数死亡鱼尾数死亡率相对免疫保护率 123 PPG1032326.770.4 PBS10108990.0/

3 讨论

随着大黄鱼养殖业的发展，高密度集约化的养殖方式致使病害、种质、环境三大问题益严重，成为制约大黄鱼养殖业发展的瓶颈。其中病害问题尤为突出，给大黄鱼养殖业带来巨大的经济损失。副溶血弧菌是引起7~9月份引起大黄鱼肠炎和皮肤溃烂的主要病原，一直缺少较为有效防控的手段。而当前主要通过化学药物和抗生素对大黄鱼病害进行防治，但是抗生素和等化学药物的治疗对养殖环境和食品安全造成严重影响，因此，疫苗等免疫制剂作为更安全有效、绿色环保的药物，得到养殖从业者们的青睐。灭活全菌苗作为最常用的疫苗已在水产养殖中得到广泛的应用，但存在抗原受损、免疫原性差等缺点。本研究通过基因克隆和原核表达的方法制备了副溶血弧菌TDH亚单位疫苗，采用注射免疫的方法评价了其免疫效果，结果发现，副溶血弧菌TDH能显著提高大黄鱼抗体水平和免疫保护率。可作为一种安全可靠、免疫效果好的药物用于大黄鱼副溶血弧菌的免疫预防。

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（2018–01–08）

浙江省自然科学基金（LY 14C190006）浙江省科技计划项目（2016F10021）

S852.61+3

C

1007-1733(2018)06-0067-03