PB试验-响应面优化白及多糖的提取工艺研究

韩 伟，彭茹洁，赵少甫

(1.华东理工大学 药学院 中药现代化工程中心，上海 200237;2.上海市新药设计重点实验室，上海 200237)

白及(Bletillastriata)是一种多年生草本植物，兰科白及属，治疗外伤出血效果良好[1]，是传统的止血药之一.随着中医药事业的发展，白及在医药生产和化妆品行业发挥着重要作用.其有效成分白及多糖，又称白及胶，具有凝血止血、促进造血、抗肿瘤、抗溃疡、抗氧化、保湿等功效[2]，在药物研发与化妆品行业有着较大的发展潜力.

目前白及多糖的提取大多采用传统的水提醇沉法，工艺繁冗复杂，周期长.微波提取[3-4]具有提取效果好、操作周期短、高效环保、溶剂消耗少等优势，已引起众多研究者的关注.表面活性剂辅助提取[5-6]也是一种新型提取技术，通过分子中不同部分对水相和油相的亲和，降低溶剂与药材间的界面张力，有利于目标成分的溶出，可提高目标组分的提取率.为了更好地提高白及多糖的提取率，可考虑将表面活性剂与微波提取法联用，以达到较佳的提取效果.此外，本实验在单因素的基础上运用了Plackett-Burman试验和响应面分析法优化该工艺，避免了在优化试验中由于因子数太多或部分因素不显著而造成耗时耗资，是一种高效、经济、快速的实验设计方法.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

白及药材，产自云南普洱；硫酸、苯酚，均为分析纯；吐温-80、司盘-80、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇400，均购自国药集团试剂有限公司.

UV1900PC型紫外-可见分光光度仪(上海亚研电子公司)；ER-692型改装的微波提取装置(中国电子器件工业总公司).

1.2 分析方法

1.2.1 总多糖的含量测定

最大吸收波长的确定：采用苯酚-硫酸法[7]测定多糖浓度，在400～600 nm波长范围扫描，确定最佳检测波长为492 nm.

葡萄糖标准曲线的建立：用移液枪吸取葡萄糖标准品溶液(质量浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mg/mL)2.0 mL于具塞试管中，依次加入1 mL 6%的苯酚溶液、5 mL浓H2SO4，沸水浴30 min，室温冷却10 min，于492 nm波长处测定葡萄糖溶液的吸光度.以葡萄糖质量浓度C为横坐标，吸光度值A为纵坐标，得标准曲线方程为A=14.404C-0.017 9，R2=0.999 5.

1.2.2 计算公式

上式中，C为稀释后的白及样品溶液中总多糖质量浓度(mg/mL)；V为相应待测白及样品溶液的体积(mL)；n为白及样品溶液的稀释倍数；m为白及药材的质量(g).

1.3 实验方法

称取白及粉末1.0 g于锥形瓶中，按一定的液固比加入含有一定浓度表面活性剂的去离子水，微波提取一段时间(微波每辐射加热20 s，暂停30 s).抽滤，定容于100 mL容量瓶中，以6 000 r/min的转速离心10 min，取离心液1 mL，稀释定容.取稀释液2 mL于25 mL比色管中，在492 nm处测定相应的吸光度，计算白及总多糖的得率.

1.3.1 单因素试验设计

分别单独考察表面活性种类(空白、吐温-80/T-80、司盘-80/S-80、十二烷基硫酸钠/SDS、聚乙二醇400/PEG400)、表面活性剂质量浓度(1、3、5、7、9、11 g/L)、微波提取时间(60、120、180、240、300、360 s)、液固比(20、30、40、50、60、70 mL/g)、微波功率(72、144、216、288、360、432、504、576、648 W)、pH值(2、4、6、7、8、10)等因素对白及总多糖提取得率的影响.

1.3.2 Plackett-Burman试验与响应面设计

当工艺优化中影响因素较多时，可采用筛选试验——Plackett-Burman试验[8]，通过分析比较各因素效应值及其显著性筛选出有显著影响的因素.本文以白及多糖得率为指标，采用响应面设计法对实验条件进行优化[9].

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 表面活性剂的筛选

图1为在表面活性剂质量浓度4 g/L、微波时间60 s、液固比30 mL/g、微波功率648 W、pH为7的实验条件下不同表面活性剂协同微波法提取白及多糖的实验结果，由图1可知聚乙二醇400(PEG400)提取效果最好.由于微波的热效应会产生大量的热量，能迅速提升提取液的温度，可能破坏某些表面活性剂的结构及性能，而聚乙二醇400作为有较高要求的热载体，在高温下仍能保持原有的结构和性能[5]，因此本文选择聚乙二醇400为表面活性剂.

图1 表面活性剂种类对白及总多糖得率的影响

图2 PEG400质量浓度对白及总多糖得率的影响

2.1.2 PEG400质量浓度

一般而言，表面活性剂浓度增大，其增溶和润湿作用的效果将增强，从而使细胞组织中目标成分的溶出率增加.图2为在微波时间60 s、液固比30 mL/g、功率648 W、pH为7实验条件下PEG400质量浓度对白及总多糖得率的影响结果，可以看出多糖得率随PEG400质量浓度的增大显著上升，当质量浓度在5～9 g/L范围内得率基本保持不变；当质量浓度超过9 g/L，得率呈下降趋势.这可能是因为当表面活性剂浓度超过临界值时，增溶和润湿作用已经趋于饱和，随着浓度的进一步增大，部分胶束被药材组织细胞所吸附，从而导致多糖得率有所下降.因此，选取PEG400质量浓度为5 g/L.

2.1.3 微波提取时间

图3为在PEG400质量浓度5 g/L、液固比30 mL/g、微波功率648 W、pH为7实验条件下微波提取时间对白及多糖得率的影响.可知：当微波辐射时间在60～240 s范围时，多糖得率随提取时间的延长而增大；当时间超过240 s，得率有所下降.究其原因可能是随着微波辐射时间的延长，微波能增加，使得药材破碎越充分，进而越容易释放出细胞内的多糖类物质.但当辐射时间过长时，高温会导致部分多糖被破坏，得率反而下降.综上，选取微波提取时间为240 s.

2.1.4 液固比

一般而言，液固比与传质推动力相关，将直接影响提取效率.图4为在PEG400质量浓度5 g/L、微波时间240 s、功率功率648 W、pH为7实验条件下液固比对白及总多糖得率的影响结果，在液固比为20～60 mL/g的范围内，随着液固比的增大，溶剂与药材细胞间的传质推动力增加，进而加快了目标物质的溶出和扩散.当液固比进一步增大时，单位体积微波能的热效应减小，多糖溶出量减少.综合考虑，确定微波提取工艺中的液固比为60 mL/g.

图3 微波提取时间对白及总多糖得率的影响

图4 液固比对白及总多糖得率的影响

2.1.5 微波功率

图5 微波功率对白及总多糖得率的影响

微波辐射条件主要涉及微波功率，本实验微波设备的功率分为9档，分别为72、144、216、288、360、432、504、576、648 W.图5为在PEG400质量浓度5 g/L、微波时间240 s、液固比60 mL/g、pH为7实验条件下微波功率对白及总多糖得率的影响，由图可知，多糖得率随功率的提高呈现先上升后下降的趋势，在576 W(第8档)达到最大值为31.77%.这主要是因为在通常情况下随着微波功率的增大，微波能的热效应也随之增加，多糖溶出加快；但当微波功率进一步增大时，微波能过大，可能导致多糖的化学结构和性质发生变化，使得最终总多糖得率下降.综上，选取微波功率为576 W.

2.1.6 pH值

图6 pH值对白及总多糖得率的影响

pH值对白及总多糖得率的影响结果如图6所示.由图可知，在PEG400协同微波提取白及多糖的工艺中，当溶液为中性时，白及多糖得率达到最大值.由于PEG400为非离子型表面活性剂，pH值对其影响不明显；白及中性多糖可能含量较多，因此当提取液过酸或者过碱时，不利于中性多糖的溶出.这里溶液的pH值控制在7左右为宜.

2.2 Plackett-Burman试验

根据上述单因素实验，对PEG400质量浓度、微波时间、液固比、微波功率以及pH值等5个因素的最优提取条件分别取高、低两个水平，Plackett-Burman试验设计因素和水平见表1.

表1 Plackett-Burman设计的因素和水平

按照Plackett-Burman试验设计，在不同的提取条件下进行实验，结果如表2.

表2 Plackett-Burman实验设计及结果

以白及多糖得率为考察指标，用Design expert 8.0软件对实验数据进行处理.分析各因素的显著性(如表3)，由于模型的P<0.05，可知该模型具有显著影响性.5个因子影响大小排序为微波功率>液固比>微波时间> pH值> PEG400质量浓度.其中液固比、微波功率和微波时间对微波提取具有显著性影响.

表3 各因素效应值及其显著性分析

2.3 响应面设计优化

根据上述Plackett-Burman试验结果，择选出微波时间、液固比和微波功率3个显著性因素，设计三因素三水平Box-Behnken响应面试验[9]，试验因素及水平见表4，实验结果及预测值见表5.

表4 响应面分析因素和水平

表5 响应面试验设计结果

表6 回归方程模型系数评估及其显著性检验

通过Design Expert 软件可得微波时间(X1)、液固比(X2)和微波功率(X3)3种因子两两交互作用对微波提取白及多糖得率影响的响应面和等值线图(见图7～图9).

图7 Y=F(X1,X2)的响应面图与等值线图

图8 Y=F(X1,X3)的响应面图与等值线图

图9 Y=F(X2,X3)的响应面图与等值线图

根据上述响应面设计试验分析，确定微波提取的最佳工艺条件：微波提取时间为300 s，液固比为62.91∶1，微波功率为529.90 W，白及总多糖得率为32.74%.由于本实验中微波装置各档的功率是固定的，考虑到实际操作的可行性，因此将理论工艺参数调整为：微波提取时间300 s，液固比63∶1，微波功率504 W(第7档)，PEG400质量浓度5 g/L，溶液pH 7，此时白及总多糖实际得率为(32.48±0.18)%.

3 结论

本文采用表面活性剂协同微波法进行白及多糖的提取，通过单因素考察结合Plackett-Burman试验和响应面分析法优化工艺参数，得到白及多糖的最佳提取条件为：PEG400质量浓度5 g/L，溶液pH 7，微波提取时间为300 s，液固比为63 mL/g，微波功率为504 W.在此优化工艺下，白及多糖的得率为(32.48±0.18)%.