褪黑素及相关基因调控哺乳动物季节性繁殖的研究进展

王延莉，金花子，金海国

（1.延边大学农学院，吉林延吉 133000；2.吉林省农业科学院畜牧分院，吉林公主岭 136100）

褪黑素（Melatonin，MT）是由松果体（Pineal Gland）和视网膜光感受器合成的一种吲哚胺。1958年由Lerner从肉牛松果体中首次分离得到，且MT的合成和分泌呈昼低夜高节律性变化[1]。MT作为一种神经内分泌信号，其作用机制复杂，其在调节生物的昼夜节律和季节性节律方面有重要作用[2]。季节性繁殖是动物适应环境的显著性特征，它可以让动物在一年中协调生理功能，但它在动物生产方面是一个不受欢迎的复杂因素，需要尽可能避免。前人研究发现，光周期处理和MT对调控动物的季节性繁殖发挥着重要作用。因此，通过了解MT和动物季节性繁殖间的联系，将有助于研究改造动物固有的季节性繁殖节律，从而提高畜牧养殖业经济效益。

1 褪黑素对季节性繁殖动物的调控作用

在长期的进化过程中，哺乳动物形成了季节性生殖节律的生活特征，这种通过复杂机制介导的精确繁殖季节使得动物能够在每年最适的生殖季节开始繁殖活动，保证后代出生在一年中最适宜的季节，便于其更好地生长发育[3]。季节性繁殖动物包括长日照繁殖动物（如猫、鼠等）和短日照繁殖动物（如绵羊、鹿等）。前人研究表明，由松果体调控MT的节律性分泌能够调节多种动物生殖，尤其是季节性繁殖动物的生殖活动[4-6]。

1.1 短日照繁殖动物 梅花鹿（Cervus Nippon）是典型的季节性短日照繁殖动物。对处于非发情期的母鹿埋植MT，可提高其体内卵泡刺激素（Follicle-stimulating Hormone，FSH）的浓度，促进卵泡发育；同时能显著增加其体内促黄体素（Luteinizing Hormone，LH）含量，有利于促进母鹿达到超排的效果[7]。绵羊（Ovis Aries）发情多在秋冬季，其繁殖活性与光照时间缩短有关。当切除绵羊松果体后，这些绵羊无法将繁殖性能与季节变化同步起来[3]。因此，有人通过皮埋MT试剂模拟短日照的MT分泌模式，发现MT会促进促性腺激素释放激素（Gonadotropin Releasing Hormone，GnRH）和LH的脉冲同时释放，从而刺激母羊的生殖活性，使其提前排卵；然而模拟长日照的MT分泌模式，发现MT会抑制LH释放和生殖活动[1]。由此推测，MT是光照周期对LH脉冲释放的调控因子。

将短日照繁殖的印第安沙鼠（Meriones Hurrianae）持续光照1个月，发现其睾丸萎缩、精子数量下降，从而抑制了其繁殖能力；但当注射外源性MT后，不仅促进了其睾丸发育，中和了连续光照对繁殖的抑制作用，而且附睾等附属性器官的厚度及表面积也有所增加[8]。以上结果表明，MT是短日照繁殖动物繁殖的活性因子。1.2 长日照繁殖动物 在长日照季节里仓鼠（Mesocricetus Auratus）有很强的繁殖活力，在短日照季节其繁殖性能降至最低。将仓鼠置于在短光照周期下，雄性出现睾丸退化，雌性进入乏情期，仓鼠的繁殖系统受到抑制[3]。对雌大鼠进行松果体切除试验后，幼年雌鼠的卵巢变肥大，性成熟提前到来，成年雌鼠则出现发情；当切除雄大鼠的松果体时，幼年雄鼠的睾丸和精囊重量增加；而给雌鼠注射MT后其卵巢重量减轻，性成熟延迟；雄鼠注射MT后睾丸和前列腺出现萎缩[1]。因此，MT有抑制长日照哺乳动物生殖活动的作用，且这种抑制性腺发育的作用是通过抑制GnRH实现。

家猫（Felis Catus）的卵巢活性随着光照时间的缩短而静止，在次年日照变长时才得以恢复[9]。研究显示，内源性MT反向调节家猫的发情周期，抑制雌激素的生成和卵泡生长[10]。MT还会导致家猫LH水平下降，可通过口服或注射外源性MT抑制雌猫卵巢的活性，从而控制猫科动物的生殖[9]。

2 褪黑素调控动物季节性繁殖的机理

MT是将光周期与生殖活动协同起来的重要信号，光照信息对生殖系统的调节作用是通过松果体分泌的MT传递到下丘脑-垂体-性腺轴（Hypothalamo-Pituitary-Gonadal Axis，HPGA）调节FSH和LH等激素的释放，从而影响性腺生殖激素分泌[4,11]。通过外源性MT促进鹿超排，MT可能通过直接与卵巢上的相应受体结合直接调节生殖激素的表达，也可能是通过HPG轴在下丘脑水平上调节促性腺激素分泌，从而间接调控下游生殖系统的活动[7]。以下主要对MT在神经内分泌水平调控哺乳动物季节性繁殖的机制进行简述。

研究表明，视网膜接收光周期信号后通过视交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）传递到下游松果体，引发松果体合成分泌（昼低夜高）MT，并通过甲状腺激素（Thyroid Hormone，TH）的作用调控哺乳动物的季节性繁殖[4]。褪黑激素受体（Melatonin Receptor，MTNR）广泛分布于垂体结节部（Pars Tuberalis， PT）产生促甲状腺激素（Hyroid Stimulating Hormone，TSH）的特异性细胞上[12]。以MT敏感的C3H小鼠为研究对象，发现TSH是MT在PT区作用的主要信号目标[13]。而TSH可以与位于下丘脑室管膜细胞上的促甲状腺激素受体（Thyroid-stimulating Hormone Receptor，TSHR）结合，从而影响室管膜细胞中脱碘酶2 （type2 deiodinase DIO3）和脱碘酶3（type3 deiodinase DIO3）的表达水平。DIO2可以将四碘甲状腺原氨酸（Tetraiodothyronine，T4）转化为TH活性更强的三碘甲状腺原氨酸（Triiodothyronine，T3），而T3和T4会被DIO3钝化。研究发现，注射TSH或将光周期从短白天变为长白天均会导致DIO2的表达显著上升，而DIO2的上升将TH前体转化为活性形式T3，从而活化促性腺轴[3]。该结论已在TSHR和MTNR缺失小鼠的研究中得到证实，并对该小鼠注射MT后未影响 DIO2/3的转换[14]。推测MT作用于其受体，并通过 TSH-TSHR通路调控DIO2/DIO3的表达，继而调节T3/T4水平，调节GnRH释放，最终对动物的繁殖活性进行调控（图1）。

图1 哺乳动物季节性繁殖调控通路[15]

哺乳动物的SCN自发振荡，直接调节Kiss-1神经元和RFRP神经元的活动。同时，SCN接受视网膜光周期信号将其传递给松果体，松果体合成分泌MT，从而影响垂体结节部TSH和脱碘酶的表达，进而将TH转化为活性形式T3，调节GnRH释放调控动物繁殖，也有可能靶向Kisspeptin和RFRP间接调节GnRH神经元的活力，从而调控繁殖的季节性变化。

光照周期影响松果体节律性分泌MT，并通过TH与作用于下丘脑内侧基底部（Mediobasal Hypothalamus，MBH）正中隆起上的TH受体作用，在哺乳动物中促性腺激素的释放完全依赖于GnRH的分泌，而在正中隆起上有GnRH神经元末梢的投射[3]。在短光照下，长光照动物GnRH神经末梢被神经胶质细胞的终足包围；但在长光照下，GnRH神经元末梢逃离终足的包围，且与毛细血管基底膜接触便于GnRH 释放入血液[3-4]，从而激活整个HPG轴。除了TH，外源MT或注射TSH都能够诱导Kisspeptin 和RF酰胺相关肽（RFamiderelatedpeptides，RFRP）的表达进而调节动物季节性繁殖[16]。总之，TSH和Kisspeptin以及RFRP都由MT响应光信号的变化来调控生殖轴的季节变化（图1）。

3 繁殖节律相关基因

季节性繁殖节律除了受光照周期的调控，还受到与繁殖相关基因的节律性调控，这些基因在“光照周期-SCN-MT-GnRH”的通路中，经不同通路最终作用于下丘脑GnRH神经元，调控动物的节律性繁殖过程。

3.1AANAT/HIOMT基因与繁殖季节性的关系 芳香烷基胺-N-乙酰转移酶（Arylalkylamine-N-Acetyltran-sferase，AANAT）与羟基吲哚-O-甲基转移酶（Hydroxyindole-OMethyltransferase， HIOMT）均高表达于松果体，是合成MT的2个主要酶，参与调控动物的季节性繁殖[17]。MT的合成分4个过程：以色氨酸为原料，经色氨酸羟化酶（TPH）羟化、5-羟色氨酸脱羧酶（5-HT-POC）脱羧、N-乙酰转移酶（NAT）乙酰化，最终在HIMOT的氧甲基化作用下生成MT。AANAT和HIOMT的合成分泌水平与MT的合成分泌水平同步，且也有昼低夜高的变化节律[18]。在大鼠松果体中，AANAT白天的活性水平极低，其昼夜活性水平差可达近百倍[19]。

许筱颖等[20]研究表明，大鼠松果腺中AANAT酶活性存在季节性节律（冬高夏低），AANAT活性变化规律与MT分泌量正相关。黄冬维[21]研究发现，MT分泌量与AANAT活性变化规律一致，辽宁绒山羊（季节性发情）松果体中AANAT/HIOMT基因表达量显著高于济宁青山羊（常年发情），这可能与两品种发情季节差异有关。因此，推测AANAT/HIOMT基因是通过介导MT的合成和分泌而进一步对哺乳动物繁殖节律性进行调控。

3.2TSHB/DIO2/DIO3基因与繁殖季节性的关系 促甲状腺素B亚基基因（Thyroid- stimulating Hormoneβ-subunit，TSHB）主要在垂体中表达，其协同TSHR能够调节下丘脑DIO2和DIO3基因的表达，继而调控TH（T3、T4、rT3、T2）的动态平衡，从而调节GnRH释放，最终对动物的繁殖活动进行调控，TSHB表达与动物季节性繁殖的光照周期调控密切相关[22]。DIO2/DIO3主要表达于下丘脑ARC和下丘脑室管膜细胞，是催化不同活性TH相互转化的关键酶，2种脱碘酶的表达变化与哺乳动物的光周期反应有关，在性腺发育和季节繁殖中起重要作用[23]。

研究表明，DIO2/DIO3基因对羊和啮齿动物的季节性繁殖活动具有重要调控作用。丁吉顺[24]对黑线仓鼠季节性繁殖探究发现，DIO2在春秋季表达量较高，其与黑线仓鼠春秋季出现繁殖高峰的事实一致，也与GnRH的季节表达模式一致，表明DIO2可能有促进调控黑线仓鼠生殖的作用；而下丘脑DIO3在春秋季表达量较高，睾丸和卵巢DIO3在冬季表达量较高，DIO3在外周性腺与中枢神经系统的表达不同，推测外周性腺DIO3在冬季的高表达可能是抑制黑线仓鼠的繁殖活动的因子之一。黄冬维等[25]研究发现，济宁青山羊垂体DIO2基因表达量显著高于辽宁绒山羊，下丘脑、卵巢表达量也均高于辽宁绒山羊，子宫表达量却显著低于辽宁绒山羊；济宁青山羊下丘脑DIO3基因表达量明显高于辽宁绒山羊，而卵巢和子宫DIO3基因表达量却显著明显低于辽宁绒山羊，且辽宁绒山羊垂体DIO3基因表达量高于济宁青山羊。推测济宁青山羊常年发情与其垂体DIO2基因的高表达有关，同理，辽宁绒山羊季节性繁殖与其垂体、卵巢和子宫DIO3基因的高表达有关。TSHB基因在济宁青山羊和辽宁绒山羊的垂体均高度表达，而济宁青山羊TSHB基因表达量约为辽宁绒山羊的1.6 倍[21]。

综上，TSHB/DIO2/DIO3基因表达差异可能反映了动物间发情季节性的差别，而季节性繁殖动物的繁殖节律性可能是由于垂体TSHB和DIO2基因表达较低或DIO3基因表达较高所致。

3.3Kiss-1/GPR54基因与繁殖季节性的关系 Kisspeptin是Kiss-1基因编码的产物，是位于GnRH神经元表面的G蛋白偶联受体54（Gprotein-coupled Membrane Receptor 54， GPR54）的内源兴奋剂，Kisspeptin能强烈刺激性腺轴[26-27]。Kiss-1和GPR54基因敲除的小鼠因具有未成熟的生殖器官及促性腺激素的表达水平很低，因此这些小鼠都不育[12,28]。Kisspeptin和GPR54在调节季节繁殖动物的繁殖活动中发挥重要作用。在哺乳动物体内Kiss-1和GPR54基因广泛表达，主要表达于下丘脑和胎盘。下丘脑弓状（ARC）的Kiss-1神经元其轴突末梢可直接投射到GnRH神经元胞体上，并建立突触连接[29]，且GPR54转录物在下丘脑中的GnRH神经元表达，表明GnRH神经元受Kisspeptin、GPR54直接调节（图1）。在灵长类动物性成熟过程中，下丘脑Kiss-1和在大脑区域Kisspeptin的释放表达增加[12,28,30]。注射Kisspeptin会通过GPR54刺激GnRH释放，使血清LH、FSH水平升高，诱导促性腺轴提前激活，青春期提前到来。以上表明Kisspeptin在HPGA上的关键作用是发生在GnRH神经元上，因此Kisspeptin 被认为是 GnRH最有力的激活者。季节性繁殖动物的生殖活动受到光周期的严格控制。在短日照情况下，MT可以抑制长日照繁殖的啮齿类动物下丘脑弓状核分泌Kisspeptin，导致其繁殖活力下降，而注射Kisspeptin可使其繁殖活力恢复[27]；在非繁殖季节给绵羊注射Kisspeptin能促使90%的母羊排卵[28,31]；黄冬维等[32]研究发现，济宁青山羊下丘脑Kiss-1基因表达量显著高于处于非繁殖季节的辽宁绒山羊。由此推断，Kiss-1基因的低水平表达是造成非繁殖季节生殖活动停止的原因。

3.4RFRP基因与繁殖季节性的关系RFRP基因于下丘脑内侧基底部（MBH）室旁核（AVPV）、背内侧核等广泛表达，RFRP的表达同样受光周期的调节[33]。在短光照繁殖的绵羊中，长光照下休情期的绵羊与短日照繁殖期的个体相比其RFRP的表达和投射增加[12]。但在啮齿类中，RFRP的光周期变化却相反，与长光照下繁殖的叙利亚和西伯利亚仓鼠相比，短光照下休情的仓鼠中RFRP表达量减少；而对光信号不敏感的大鼠，即使将其置于短光照中长达2个月，RFRP表达水平也没有变化。中等强度的光照可增加西伯利亚仓鼠RFRP的表达[33]。弓形核中Kisspeptin与室旁核中RFRP在控制绵羊节律性繁殖上发挥相反作用，在繁殖季节，Kisspeptin-GnRH接触更多，来源于Kisspeptin的刺激更多地传输给GnRH神经元；在非繁殖季节，RFRPGnRH接触更少，来源于RFRP的抑制更多传输给GnRH神经元[33]。Kisspeptin和RFRP作用相反，但彼此相互协同，调节不同季节下丘脑GnRH神经元的活性，使动物繁殖力随着季节更替从非繁殖季节到繁殖季节的周期性转变[33-34]（图1）。

光照周期通过MT介导RFRP的表达。与短日照繁殖的绵羊相比，长日照下休情期的绵羊 RFRP 的表达增加；在啮齿类中，RFRP 的光周期变化却出现相反模式，与长光照繁殖的仓鼠相比，短光照个体RFRP表达下降[12]，说明RFRP可能在长光照下表达量增加，短光照下表达降低。切除松果体的仓鼠，其RFRP的短光照抑制效应消失，将其置于长光照中并连续注射MT 60 d，仓鼠RFRP的表达水平下降，达到了与短光照仓鼠水平一样。综上，RFRP基因可能是节律性繁殖的“抑制因子”[33]，但另有研究发现，济宁青山羊下丘脑RFRP表达量高于休情期辽宁绒山羊，这与其可能是节律性繁殖的抑制因子不符[32]。因此，RFRP基因是否对哺乳动物的繁殖节律有调控作用或以何种方式调控还有待进一步研究。

3.5MTNR基因与季节性繁殖的关系 MT被认为是季节性变化的信号传递到季节性繁殖物种的神经内分泌系统的主要分子。MT通过其特定的受体MTNR1A和MTNR1B发挥作用。

3.5.1MTNR1A基因 研究表明，MTNR1A的多态性与繁殖的季节性有关[28]。Chu等[35]用RsaI酶切全年发情品种山羊和季节性发情品种山羊的MTNR1A基因第2外显子的PCR产物，结果显示，全年发情的济宁青山羊只检测到RR基因型，在其他山羊品种中均检测到RR型和Rr型，未检测到rr型。分析结果表明，RR型与山羊全年发情关联，Rr型与山羊季节性发情关联。Muranium等[36]用Rsa I和Mnl I酶切Sarda绵羊MTNR1A第2外显子扩增片段，以分别检测T606C和A612G多态性，发现携带GG、GA、CC和CT基因型的母羊与AA和TT基因型相比，在引入公羊和分娩之间表现出更高的生育率和更少的天数。数据显示MTNR1A基因多态性影响了Sarda绵羊品种季节性繁殖。Luridiana等[37]用Hpa I对水牛MTNR1A第2外显子进行酶切，得到CC、CT和TT基因型，CC基因型个体第1次与第2次产犊间隔比CT和TT个体长，表明MTNR1A基因多态性与水牛的季节性繁殖活动相关。

也有研究表明，MTNR1A与动物繁殖季节性无关。王琼等[38]发现，策勒黑羊的MTNR1A基因不存在多态性。Hernandez等[39]以12对半同胞成年Ile-de-France母羊为研究对象，发现MTNR1A基因多态性与该母羊季节性繁殖无关。推测这些多态性可能受品种或环境条件影响，也有可能MTNR1A基因对哺乳动物季节性繁殖只起微调作用[40]。

3.5.2MTNR1B基因 由于MTNR1B和MTNR1A基因结构非常相似，有些研究者认为MTNR1B基因也可能对季节性繁殖具有一定的作用[41]。Von等[42]发现，在MTNR1A受体靶向缺失的小鼠中，MT对视交叉上核（SCN）多单位活性的急性抑制作用被完全消除。然而，啮齿动物SCN中的功能性MTNR1B受体部分能够弥补MTNR1A基因敲除小鼠中MTNR1A受体的缺失。Jin等[43]发现，MTNR1B基因靶向破坏的小鼠没有明显的昼夜节律表型，MT可以抑制MTNR1B基因敲除小鼠中SCN中的多单位电活性。以上结果表明，哺乳动物体内夜晚分泌的MT使其SCN中内源MTNR1B的敏感度降低，从而影响动物生殖。

4 小 结

光周期协同MT的内源性节律变化诱导动物形成固定的生殖节律。“光周期-MT-Kiss-1/GPR54-RFRPGnRH”是调控动物季节性繁殖的主要路径，此类研究正在不断深入，相信随着高通量测序分子生物技术的高速发展，将会完整地揭示季节性生殖节律的调控机理，改造动物固有的季节性繁殖节律将会成为可能，为进一步提高动物的繁殖力和生产性能以及为畜牧业发展带来福音。