对羟基苯甲醇对小白菜天麻素积累和生长的影响

2018-12-19易怀锟江灵敏何彦刘鹏李笑张玉蓉谭朝阳b徐德宏b

浙江农业科学 2018年12期

易怀锟，江灵敏，何彦，刘鹏，李笑，张玉蓉，谭朝阳b*，徐德宏b*

(湖南中医药大学a药学院生物工程实验室，b生物转化实验室，湖南长沙 410208)

天麻素(化学名：4-羟甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，Gastrodin)及其苷元(对羟基苯甲醇)是天麻块茎中两种主要的有效成分[1]，具有镇静、催眠、镇痛、增强免疫等作用，在临床上广泛用于治疗心脑血管、微循环系统疾病，对头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫、抽搐、破伤风等病症有显著疗效且无明显副作用[2-5]。天麻是提取天麻素的主要来源，但野生资源匮乏且含量较低，故有必要采用其他方法来获取天麻素。目前，在人工栽培方面虽取得了进展，但由于天麻种植所需生长环境的条件苛刻，以及栽培过程中天麻品质逐渐降低的问题，导致天麻素原料的大量供应很难保证[6-7]。除此之外，还有其他方法可以合成天麻素，例如植物组织或细胞培养法[8-11]、化学合成法[12-14]等。其中，组织和细胞培养法通过优化培养基条件和添加前体物质来提高产量和收率，但周期长、成本高。由于天麻素含葡萄糖基，化学合成法需要经过多步的保护和去保护措施，过程复杂且成本高，副产物较多且难于分离，因此以上这些方法均未能用于天麻素的大规模生产。

小白菜原产于我国，具有栽培成本低廉、栽培技术简单且栽培面积广泛等特点，是一种广受人民喜爱的蔬菜，其营养成分主要有可溶性糖、可溶性蛋白、纤维素、维生素C等[15]。葡萄糖基转移酶在植物体内普遍存在，是催化底物发生糖基化的酶[16-17]，但多数植物在自然条件下不能自发产生对羟基苯甲醇，因而也就不含天麻素。本研究试图通过水培法对不含天麻素的小白菜直接体外供给对羟基苯甲醇，研究对羟基苯甲醇对小白菜生长和天麻素积累的影响，为今后既经济又高效地大规模利用小白菜水培生成天麻素，并进一步开发成为一种保健蔬菜奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Agilent 1260 HPLC-6530 Accurate-Mass Q-TOFLC/MS液质联用仪；日本岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪。天麻素对照品：中国食品药品检定研究院，批号为11807-200205；对羟基苯甲醇：武汉金诺化工有限公司，批号为SH0530；甲醇、乙腈为色谱纯，其余均为分析纯。小白菜种子(南京秋田种业研究所，检疫证明编号：3201000020100106)由湖南中医药大学谭朝阳教授购于湖南省长沙市望城市场。

1.2 方法

1.2.1 营养液配制

采用的营养液配方为华南农业大学叶菜配方。大量元素配方：A液含Ca(NO3)2·4H2O 472 mg·L-1、KNO3202 mg·L-1、NH4NO380 mg·L-1；B液含KH2PO4100 mg·L-1、K2SO4174 mg·L-1、MgSO4·7H2O 246 mg·L-1。将大量元素的各种化合物扩大400倍后用电子天平称量，并分别用蒸馏水溶解配成A液和B液的母液。微量元素配方(C液)：FeSO4·7H2O 27.8 mg·L-1、EDTA-2Na 37.2 mg·L-1、H3BO32.86 mg·L-1、MnSO4·4H2O 2.13 mg·L-1、ZnSO4·7H2O 0.22 mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.08 mg·L-1、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.02 mg·L-1，将各化合物称量扩大1 000倍，用电子天平称取后混合在一起溶解并装在棕色储器内。使用时分别取大量元素A母液和B母液各25 mL加入6 L水中，边加边搅拌直到没有沉淀之后，加入微量元素母液10 mL并定容至10 L。

1.2.2 处理设计

将正常生长的小白菜按每组12株分为A、B、C、D共4组，A组为对照组，营养液中不加对羟基苯甲醇，B、C、D组为实验组，分别在营养液中添加1、2、3 mmol·L-1对羟基苯甲醇。以上4组小白菜在25 ℃恒温玻璃大棚中培养，每隔6 d更换一次含相应浓度对羟基苯甲醇的营养液，同时采收3株小白菜，记录每株小白菜的株高和根长，并按以下方法进行天麻素含量测定。首先，每株小白菜取10 g叶片剪碎，加入50%甲醇10 mL，精密称量后加热回流1 h，用50%甲醇补足加热回流损失的质量，并用滤纸过滤后取过滤液作为供试品溶液。其次，精密称量天麻素标准品和对羟基苯甲醇标准品，分别加入50%甲醇制成每1 mL中含0.05 mg的标准品溶液，并按1∶1混合后用于色谱检测。最后，用0.45 μm微孔滤膜过滤供试品溶液和标准品溶液，进行HPLC检测，根据两者检测得到的色谱峰面积换算供试品溶液中天麻素的含量。色谱检测条件：Agilent 20RBAX C18柱(4.6 mm×250 mm,3.5 μm particle size)，流速1 mL·min-1，流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液(体积比3∶97)，检测波长为220 nm，柱温为40 ℃，进样量为20 μL。

1.2.3 天麻素的液相色谱质谱联用(LC-MS)检测

为进一步确定转化产物是天麻素，将1.2.2节制备的供试品溶液进行LC-MS检测。其中色谱检测条件为Agilent ZORBAX Bonus-RP色谱柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)，流动相为甲醇-0.1%甲酸溶液(体积比6∶94)，检测波长为220 nm，流速为0.5 mL·min-1，进样量为10 μL，柱温为40 ℃。质谱检测条件为电喷雾正离子模式，雾化气温度为325 ℃，干燥气流速为6 L·min-1，喷雾器压力为0.28 MPa，鞘气温度为350 ℃，鞘气流速为12 L·min-1，毛细管电压为4 000 V，碎裂电压为110 V，质谱核质比采集50～1 000。

2 结果与分析

2.1 小白菜转化对羟基苯甲醇生成天麻素的色谱检测

HPLC检测结果(图1)表明，在小白菜水培营养液中添加前体物质对羟基苯甲醇后，叶片甲醇提取物中存在天麻素和对羟基苯甲醇，说明小白菜可通过根系从营养液中吸收前体物质并将其转运至叶中，然后利用叶肉细胞中的相关糖基转移酶，催化对羟基苯甲醇发生葡萄糖基化生成天麻素。另外，也说明葡萄糖基转移酶广泛分布在植物体内，当有相应前体物质存在时，它们能催化这些前体物质发生糖基化生成糖苷，推测多数植物在自然条件下不能自发产生天麻素，其中一个重要原因与自身不能合成对羟基苯甲醇有关。

A，天麻素和对羟基苯甲醇标准品的色谱图。将两种标准品按1∶1混合后进行色谱检测，保留时间14.461 min的峰为天麻素标准品，保留时间28.629 min的峰为对羟基苯甲醇。B，小白菜甲醇提取液的色谱图，保留时间14.469 min的峰为小白菜转化生成的天麻素，保留时间28.744 min的峰为小白菜吸收的对羟基苯甲醇经转化后在叶片中的残留物图1 小白菜转化对羟基苯甲醇生成天麻素的色谱检测结果

2.2 小白菜转化对羟基苯甲醇生成天麻素的质谱鉴定

对小白菜HPLC图中与天麻素标准品具有相同保留时间的色谱峰进行质谱检测，结果(图2)显示，此峰所含物质可与溶液中H+、NH4+、Na+、K+形成不同的复合物，所得一级质谱的核质比(m/z)分别为287.115 9、304.139 2、309.094 4、325.068 1。减去以上结合离子的分子量后，所得数值与天麻素理论分子量286.277 8 u相同，表明小白菜转化得到的峰含有天麻素，并进一步证实小白菜体内含有可以将对羟基苯甲醇转化成天麻素的糖基转移酶。

图2 小白菜转化对羟基苯甲醇生成天麻素的质谱鉴定结果

2.3 对羟基苯甲醇和培养时间对小白菜积累天麻素的影响

结果(图3)显示，添加不同浓度对羟基苯甲醇后，小白菜体内均能合成天麻素，而且在第6天时小白菜转化生成天麻素的含量最高，此后随着培养时间的延长，天麻素在小白菜体内的含量则逐渐降低。另外，随对羟基苯甲醇浓度的增加，小白菜在第6天转化生成天麻素的量也逐渐增加。以上研究结果可以说明两个问题，一是小白菜对前体物质的转化具有一定的浓度依赖性，即前体物质浓度的增大会导致天麻素转化量也随之增大；二是小白菜对天麻素的积累受时间长短的影响，在以后大规模水培小白菜获取天麻素时，要注意小白菜采收时间，同时还要进一步寻找其他方法来延缓或阻断天麻素在小白菜体内的消耗。另外，根据天然状态下小白菜不含天麻素这一基本事实，推测出现以上天麻素逐渐被消耗的原因，可能与天麻素作为一种小白菜非必须次生代谢物有关，因为当天麻素在小白菜体内产生之后，为了满足自身营养所需，小白菜会继续代谢天麻素生成其他营养物质，从而导致天麻素难以在小白菜中长期积累。

A组为采用水培方式不加对羟基苯甲醇的对照组，B、C、D组为采用水培方式分别添加1、2、3 mmol·L-1对羟基苯甲醇的实验组。每组结果均来自3株水培小白菜，以平均数±标准差的方式进行表示。图4同图3 不同浓度对羟基苯甲醇和培养时间对小白菜积累天麻素的影响

2.4 对羟基苯甲醇对小白菜生长的影响

水培植物时，营养液中物质成分的变化会直接影响植物的生长状况。本实验添加的前体物质对羟基苯甲醇为小白菜生长非必须物质，通过测量根长和株高来反应对羟基苯甲醇对小白菜生长状况的影响。图4显示加入对羟基苯甲醇后，小白菜的平均根长在前12 d内逐渐增大，但12 d后由于老根逐渐死亡而出现平均根长开始变短的现象。根作为植物吸收营养物质一个重要器官，其生长好坏会直接影响整个植株个体特别是株高的生长状况。在水培前18 d小白菜的平均株高都在增长，但18 d后其平均株高则停止生长，这一现象与对照组形成了鲜明对比。综合可知，对羟基苯甲醇作为营养液添加物质对小白菜生长有害，这与酚类物质对其他植物生长有负面影响相同[18-20]，但小白菜能在较短时间和一定浓度范围内抵抗对羟基苯甲醇的危害，而且这种抵抗能力与对羟基苯甲醇浓度和施加时间呈负相关，可为进一步探讨合适浓度的对羟基苯甲醇用于大量积累天麻素提供依据。