海洋芽孢杆菌N11-8产蛋白酶的发酵条件优化*

朱祥杰 王 震 苑志欣 郝建华 郑兰红



海洋芽孢杆菌N11-8产蛋白酶的发酵条件优化*

朱祥杰1,2王 震1,2苑志欣1郝建华1郑兰红1①

(1. 农业农村部极地渔业开发重点实验室 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071；2. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306)

本研究采用响应面法(RSM)对南极海洋芽孢杆菌(sp.)N11-8液体发酵产蛋白酶PBN11-8的发酵条件进行快速优化。通过单因素实验初步确定南极海洋芽孢杆菌N11-8产蛋白酶的最佳碳源和氮源分别为可溶性淀粉和蛋白胨；并通过Plackett-Burman(PB)设计对影响其产酶相关因素进行评估，筛选出具有显著效应的3个因素：温度、氮源和碳源；以最陡爬坡实验逼近至上述因子最大响应区域，进而采用RSM法对其最佳水平范围进行研究，确定最优发酵条件为：可溶性淀粉3 g/L，蛋白胨13.1 g/L，酵母浸粉2.9 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO41 g/L，FeCl3·6H2O 2 mmol/L，初始pH值为7.0，温度为34.0℃，转速为200 r/min，装液量为50 ml/250 ml，接种量为4%，培养时间为60 h。最终优化后的酶活达到90.5 U/ml，比初始酶活提高了23.6%。

芽孢杆菌；蛋白酶；Plackett-Burman设计；响应面法

蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称，在动植物、微生物中均有分布。产蛋白酶的微生物种类主要包括细菌、霉菌和放线菌等(史翠娟等, 2015)。蛋白酶在医学领域主要用于治疗心血管病等疾病，同时在治疗脓毒症、消化系统疾病、炎症、囊性纤维化、视网膜疾病和牛皮癣等疾病方面也有所应用(Gomis-Ruth, 2003)。目前，在食品、洗涤剂、化妆品及抗肿瘤药物等和疾病的机理研究等方面也有诸多应用(荆谷等, 2002)。迄今为止，有关抗肿瘤活性蛋白酶只有少量报道(Weildle, 2014; 纪明开等, 2017)。

芽孢杆菌(sp.)N11-8由南极表层海水中分离获得(Zheng, 2016)，其所产蛋白酶PBN11-8具有较好的应用潜力(郑兰红等, 2015)。为获得更高的产酶量，对芽孢杆菌N11-8的培养基与培养条件进行优化。优化实验采用正交实验或响应面实验，其中，正交实验是一种高效处理多因素优化问题的方法，采取部分实验代替全面实验(何磊等, 2011; 李洪康等, 2016)。响应面法是采用拟合因素响应值之间的函数关系，精确分析因子与响应值关系以优化工艺参数的方法，适用性强(刘志祥等, 2009)。响应面法明显优于正交实验，具有实验次数少、周期短、精度高等特点，可快速有效确定多因子系统最佳条件(刘志祥等, 2009; 王茜等, 2015)。本研究通过单因素法进行前期优化，再运用响应面法建立模型，分析处理验证，确定培养基与培养条件，从而提高蛋白酶活力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与培养 芽孢杆菌N11-8由南极表层海水分离获得(Zheng, 2016)。ND培养基(牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH 7)；固体ND培养基(牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂2%，pH 7)。

1.1.2 实验试剂 葡萄糖、Folin-酚、干酪素等(国药集团化学试剂有限公司)，蛋白胨(北京双旋)，可溶性淀粉(汕头市西陇化工)，酵母浸粉(英国Oxoid公司)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶活力测定 采用Folin-酚法测定蛋白酶活力，具体方法参考国家标准GB/T 23527-2009。每毫升酶液在30℃、pH 8条件下水解酪蛋白，每分钟释放1 μg酪氨酸所需的酶量定义为1个酶活单位(杨娟等, 2017)。

1.2.2 单因素实验 在发酵培养基的基础上，其他条件不变，依次测定不同碳源、不同氮源、碳源浓度、氮源浓度、磷酸盐浓度、NaCl浓度、不同金属离子、金属离子浓度、接种量、装液量、转速、温度和初始pH对菌株产酶的酶活影响(马子宾等, 2015; 张丹等, 2011; 张增祥等, 2010)。

1.2.3 响应面优化实验 Plackett-Burman(PB)实验参照王东等(2016)和梁昌聪等(2014)，在单因素实验结果基础上，选出7个对产酶量有较大影响的因子(可溶性淀粉、蛋白胨、酵母浸粉、NaCl、FeCl3·6H2O、KH2PO4)，设计PB实验(表1、表2)，进一步筛选出3个显著影响因子。最陡爬坡实验根据PB实验的结果，以蛋白胨、酵母浸粉、温度为主要影响因素设计本实验，培养基中其他因素分别为可溶性淀粉(3 g/L)、NaCl (5 g/L)、FeCl3·6H2O (2 mmol/L)、KH2PO4(1 g/L)、装液量(50 ml)，转速(200 r/min)，培养时间(60 h)(表4)。中心组合实验分别以蛋白胨添加量、酵母浸粉添加量和温度为自变量，以蛋白酶的酶活为指标进行液体发酵条件优化(表5、表6)。

1.3 数据统计与分析

采用Design-Expert软件(Version 7.0 Stat-Ease Inc., USA)对响应面实验得到的数据进行线性回归和方差分析。模型及因素的显著性均通过值考察(<0.05)，所有实验重复3次，结果以蛋白酶酶活力表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 不同碳、氮源对芽孢杆菌N11-8液体发酵的影响 从图1a可以发现，当可溶性淀粉为碳源时，产酶量最高。因此，培养基最适碳源为可溶性淀粉。酶的合成往往受到分解代谢阻遏的控制。葡萄糖等易代谢的碳水化合物对细菌的蛋白酶产量都有阻遏作用，在实践中往往采用代谢缓慢的碳源，或者降低糖浓度并采用连续流加法(郭军等, 2003)。图1b显示，在实验选取的7种氮源中，蛋白胨具有最强的竞争力(产酶量最高)。

图1 不同碳、氮源对芽孢杆菌N11-8产蛋白酶的影响

2.1.2 不同碳、氮源浓度对芽孢杆菌N11-8液体发酵的影响 图2a显示，随着可溶性淀粉浓度的不断增加，产酶量逐渐上升；可溶性淀粉浓度达到3 g/L时，产酶量达到最高。因此，可溶性淀粉浓度宜取 3 g/L。从图2b可以发现，随着蛋白胨浓度的增加，产酶量不断增加，在蛋白胨浓度达到15 g/L时，产酶量达到最高。因此，蛋白胨浓度宜取15 g/L。从图2c可知，在酵母浸粉浓度达到2.5 g/L时，产酶量达到最高。因此，酵母浸粉浓度宜取2.5 g/L。

图2 不同浓度可溶性淀粉、蛋白胨或酵母浸粉对芽孢杆菌N11-8产蛋白酶的影响

2.1.3 不同盐浓度对芽孢杆菌N11-8液体发酵的影响

图3a显示，磷酸盐浓度在1 g/L时，产酶量达到最高。因此，磷酸盐浓度宜取1 g/L。由图3b可以看出，NaCl浓度在5 g/L时，产酶量达到最高。因此，NaCl浓度宜取5 g/L。

图3 不同盐浓度对芽孢杆菌N11-8产蛋白酶的影响

2.1.4 金属离子对芽孢杆菌N11-8液体发酵的影响

图4a显示，当加入FeCl3·6H2O时，产酶量最高，即Fe3+对酶活促进作用最强。Fe2+对酶活促进作用略低于Fe3+，Ca2+、Al3+、Mn2+对酶活也有一定的促进作用，而Mg2+、Cu2+、Zn2+对酶活都有不同程度的抑制作用，尤其Zn2+几乎可使蛋白酶完全失活。随着样品中Fe3+浓度的增加，产酶量不断增加，当达到2 mmol/L时，产酶量最高(图4b)，故培养基中宜添加终浓度为2 mmol/L的FeCl3·6H2O。

图4 金属离子对芽孢杆菌N11-8产蛋白酶的影响

2.1.5 接种量与装液量对芽孢杆菌N11-8液体发酵的影响 图5a显示，接种量在4%时，产酶量达到最高。因此，接种量宜为4%。从图5b可以看出，装液量在50 ml时，产酶量达最高。因此，装液量宜为50 ml。在较高的装液量水平时，产酶量减少，可能主要是由于溶氧较低、供氧不足造成的(陈世建等, 2014)。

图5 接种量与装液量对芽孢杆菌N11-8产蛋白酶的影响

2.1.6 转速与温度对芽孢杆菌N11-8液体发酵的影响

图6a显示，转速在200 r/min时，产酶量达到最高。因此，转速宜为200 r/min。图6b显示，温度在35℃时，产酶量达到最高。因此，温度宜为35℃。

图6 不同转速与温度对芽孢杆菌N11-8产蛋白酶的影响

2.1.7 初始pH与时间对芽孢杆菌N11-8液体发酵的影响 图7a显示，初始pH=7时，产酶量达到最高。因此，初始pH宜为7。然而，随着时间增加，产酶量不断增加，并在60 h后趋于稳定，产酶量达到最高。因此，时间宜为60 h (图7b)。

图7 初始pH与时间对芽孢杆菌N11-8产蛋白酶的影响

2.2 响应面法优化发酵培养基及发酵条件

2.2.1 PB实验主要因子筛选 如表1所示，从单因素实验中选取7个因素：可溶性淀粉浓度、蛋白胨浓度、酵母浸粉浓度、NaCl浓度、FeCl3·6H2O浓度、KH2PO4浓度、温度，选择高低2个水平，设计实验，通过PB实验为响应面优化条件筛选出主要影响因子。12组实验的实验结果如表2所示。由表3可知，发酵条件的显著影响因子依次为蛋白胨浓度、温度和酵母浸粉浓度。

表1 Plackett-Burman实验因子水平

Tab.1 The level of factors in Plackett-Burman assay

表2 Plackett-Burman实验筛选主要影响因素

Tab.2 Screening of main influence factors in Plackett-Burman

表3 Plackett-Burman实验统计分析

Tab.3 Statistical analysis of the Plackett-Burman assay

*：差异显著(<0.05)

*: Significant differences (<0.05)

2.2.2 最陡爬坡实验 根据PB实验统计分析结果，以蛋白胨、酵母浸粉、温度为主要影响因素设计本实验，具体设计方法及实验结果如表4所示。显然，第4组实验的单位酶活最高，这说明产酶最优点在第4组附近。

2.2.3 中心组实验确定显著因素最优水平 以最陡爬坡实验的最优组第4组为中心，采用二次回归旋转中心组合设计，进一步确定蛋白胨、酵母浸粉、温度对菌株产酶的影响。具体设计和实验结果见表5和表6。

表4 最陡爬坡路径设计方法及实验结果

Tab.4 Experimental design and results of steepest ascent and corresponding results

表5 中心组合因素与水平

Tab.5 Factors and coded values of central composite test design

用Design-Expert V 8.0.6对实验数据进行多项式回归分析，<0.0001表明该模型是显著的，同时，失拟项=0.0970>0.05表示该模型失拟不显著，因此，该模型是合适的。另外，此模型2=0.9714，表明该模型能较好地的解释菌株产酶量的变化。以单位酶活()为因变量，蛋白胨()、酵母浸粉()和温度()为自变量，建立回归方程式如下：

表6 中心组合实验设计及结果

Tab.6 Experimental design and the results of central composite test

表7 响应面模型方差分析

Tab.7 Variance analysis of the response surface model

注：2=97.14%，Adj.2=94.56%。<0.05表明模型中各项都是显著的。*：差异显著(<0.05)，**：差异高度显著(<0.01)，***：差异极显著(<0.001)

Note:2=97.14%, Adj.2=94.56%.<0.05 showed all factors in the model are significant. *: Significant differences (<0.05), **: Highly significant differences (<0.01), ***: Extremely significant differences (<0.001)

酶活=89.56‒2.98+2.34‒2.96‒5.14+1.06+ 0.51‒6.712‒5.882‒7.982

根据上面的方程绘制响应面分析图、等高线图(图8)，直接反映了各因素对酶活的影响。

用Design-Expert V8.0.6计算，对回归方程求一阶偏导数，得出模型极值点。即当蛋白胨浓度为13.1 g/L、酵母浸粉浓度为2.9 g/L、温度为34℃时，酶活力最大，理论最大值为90.8 U/ml。

2.2.4 验证实验 以上述响应面分析得到的最佳培养基成分与培养条件下，进行3次实验，实际测定平均酶活为90.5 U/ml，和理论值90.8 U/ml基本一致，表明方程拟合度很好，验证了模型的正确性。

3 结论

本研究通过单因素法和响应面法对来自南极表层海水的一株海洋芽孢杆菌N11-8产蛋白酶PBN11-8的培养基成分和培养条件进行了优化，利用实验设计软件Design-Expert建立相应数学模型，经检验证明该模型合理可靠，能够较好地预测并用于优化该菌产蛋白酶发酵条件。对影响产酶量的关键因素及其相互作用进行探讨后，最终确定了以可溶性淀粉(3 g/L)为碳源，蛋白胨(13.1 g/L)和酵母浸粉(2.9 g/L)为复合氮源，Fe3+(2 mmol/L)为金属离子，初始pH值为7.0，用NaCl(5 g/L)调节盐度，250 ml三角瓶装液50 ml，接种量为4%，34℃、200 r/min发酵培养60 h，最终优化后的酶活达到90.5 U/ml，比初始酶活73.2 U/ml提高了23.6%。

图8 不同因素对酶活响应值的影响

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Optimization of Fermentation Conditions ofsp. N11-8 on the Production of Protease PBN11-8

ZHU Xiangjie1,2, WANG Zhen1,2, YUAN Zhixin1, HAO Jianhua1, ZHENG Lanhong1①

(1. Key Laboratory of Sustainable Development of Polar Fishery, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

In this study, we optimized fermentation conditions to increase the production of PBN11-8 bysp. N11-8. Response surface methodology (RSM) is a generally available method used to optimize the fermentation conditions of proteases, by fitting factors function relation between response value. The optimal carbon and nitrogen sources for protease production bysp. N11-8 were starch and peptone respectively, which were verified in single-factor experiments. Other optimal fermentation conditions were determined as follows: temperature 35℃, incubation time 60 h, rotational speed 200 r/min, pH 7, initial inoculums 4%, culture volume 50 ml in a 250 ml shake flask, and starch, peptone, yeast extract, NaCl, KH2PO4,and metal ions (Fe3+) concentrations of 3 g/L, 15 g/L, 2.5 g/L, 5.0 g/L, 1.0 g/L, and 2.0 mmol/L, respectively. The Plackett-Burman design (PB) method was used to evaluate factors affecting protease production bysp. N11-8, and three significant factors were identified: temperature, peptone, and yeast extract. Next, we used the steepest ascent design to approach the maximum response area of the three factors. Furthermore, the best scope of fermentation conditions was studied using a central composite test design, which is a type of RSM. Finally, through analysis of variance for the RSM, we obtained a regression equation and calculated the theoretical optimal fermentation conditions as follows: 3 g/L of soluble starch, 13.1 g/L of peptone, 2.9 g/L of yeast extract, 5 g/L of NaCl, 1 g/L of KH2PO4, 2 mmol/L of Fe3+, pH 7.0, temperature 34℃, rotational speed 200 r/min, culture volume 50 ml/250 ml, initial inoculums of 4%, incubation time 60 h. Under the optimized fermentation conditions, the theoretical enzyme activity reached 90.8 U/ml, and in the verification test, enzyme activity reached 90.5 U/ml, which increased 23.6% of the initial enzyme activity.

sp; Protease; Plackett-Burman design; RSM

ZHENG Lanhong, E-mail: zhenglh@ysfri.ac.cn

朱祥杰, 王震, 苑志欣, 郝建华, 郑兰红. 海洋芽孢杆菌N11-8产蛋白酶的发酵条件优化. 渔业科学进展, 2018, 39(6): 155–163

Zhu XJ, Wang Z, Yuan ZX, Hao JH, Zheng LH. Optimization of fermentation conditions ofsp. N11-8 on the production of protease PBN11-8. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(6): 155–163

* 中国水产科学研究院基本科研业务费(2014B01YQ01)和山东省科技发展计划项目(2014GSF121016)共同资助[This work was supported by the Special Scientific Research Funds for Central Non-Profit Institutes, Chinese Academy of Fishery Sciences (2014B01YQ01), and the Science and Technology Development Plans of Shandong Province (2014GSF121016)]. 朱祥杰，E-mail: zhuxiangjie1204@163.com

郑兰红，副研究员，E-mail: zhenglh@ysfri.ac.cn

2017-10-09,

2017-11-14

10.19663/j.issn2095-9869.20171009002

S917.1

A

2095-9869(2018)06-0155-09

(编辑 马璀艳)