转透明颤菌血红蛋白基因里氏木霉菌株固体发酵产纤维素酶的能力研究

左婕，严琳，王安，陈啟月，伍红

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

纤维素酶是降解天然纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称[1]，其主要来源为微生物。里氏木霉菌（Trichoderma reesei）为好氧丝状真菌，在工业上用于生产分解不同植物材料的酶类[2]，是公认的产纤维素酶最高的菌株之一[3]，具有产量高、易培养、稳定性好等优点[4]。透明颤菌为专性好氧革兰氏阴性丝状菌，在低氧环境中能够合成可溶性的透明颤菌血红蛋白（VHb）而旺盛生长。研究发现，当氧浓度较低时，该蛋白可以结合氧增大表达量，提高宿主菌摄氧和能量利用效率，使宿主菌在限氧条件下保持高水平的细胞生长和蛋白质合成，在工程菌中得到广泛运用[5-7]。

本试验比较了转透明颤菌血红蛋白基因里氏木霉菌株和普通里氏木霉菌株固体发酵产纤维素酶的能力，并利用响应面法[8-11]优化了转透明颤菌血红蛋白基因里氏木霉菌株固体发酵产纤维素酶的培养条件，为该基因工程菌株在未来生产实际中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 转透明颤菌血红蛋白基因里氏木霉Tu6-VHb菌株、里氏木霉Tu6菌株，均由中国科学院微生物研究所提供。

1.1.2 斜面培养基 马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g、尿苷1.221g，蒸馏水1000mL，pH值自然。

1.1.3 固体发酵基础培养基 向不同碳源配比的固体培养物中（固体发酵培养基总量为4g）加入不同氮源配比的Mandels营养液（营养液氮源添加总量为2.5g/L）及尿苷（1.221g/L）。

1.2 方法

1.2.1 固体发酵产纤维素酶 吸取已保存菌液于PDA培养基平板中央，30℃恒温培养6～7 d。待孢子成熟，加入适量生理盐水过滤除去菌丝体，并计数得到1×106个/mL孢子悬浮液，按6%的体积分数接种于固体培养基中，30℃培养72h。

1.2.2 提取纤维素酶粗酶液 固体发酵结束后加入40mL醋酸-醋酸钠缓冲液（pH值4.8），30℃振荡提取60min，随后将溶液以8 000 r/min离心10min，取上清液。

1.2.3 纤维素酶活力测定 向试管中加入0.5mL粗酶液和1 mL pH值4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，预热到50℃，加入50mg滤纸条，50℃水浴60min后加入3mL DNS，煮沸5 min，冰上冷却，加蒸馏水定容至25mL，540nm波长测OD值，计算酶活。纤维素酶滤纸酶活力的定义：在pH值4.8、温度50℃条件下，每分钟催化底物水解生成1μg葡萄糖的酶量为1个活力单位U。

1.2.4 Plackett-Burman试验（P-B试验） 取单因素，分别为碳源配比、氮源配比、初始含水量、接种量、发酵时间、吐温-80含量、初始pH值，设高低两个水平，以滤纸酶活力为指标，通过SPASS对单因素数据进行分析，然后用Design expert 8.0进行P-B试验设计，筛选出影响Tu6-VHb菌株固体发酵产纤维素酶的3个重要因素。

1.2.5 最陡爬坡试验 响应面只有在临近最佳值时才能建立有效的响应面方程。最陡爬坡法以响应值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，快速逼近最大响应区域。

1.2.6 响应面Box-Behnken试验（B-B试验） B-B试验采用响应面法，设计对Tu6-VHb菌株固体发酵产纤维素酶的分析试验。根据拟合出的二次多项式，得到预测值和最佳发酵条件。响应面回归模型为：

式子中，Y 为预测响应值，β0为截距，βi、βii、βij为回归系数，Xi、Xj为各个因素。

用Design expert 8.0软件设计3因素3水平的响应面分析试验，并对试验结果进行响应面分析，确定最佳发酵条件，依据回归方程绘制响应面图和等高线图。

2 结果与分析

2.1 Tu6-VHb菌株和Tu6菌株产纤维素酶活力的比较与分析 Tu6-VHb菌株和Tu6菌株在相同培养条件下发酵产纤维素酶，测得的滤纸酶活力见图1。

图1 Tu6-VHb和Tu6在120h内所产酶活力的比较

由图1可知，随着发酵时间的增加，酶活力均呈现先增大后减小的趋势，成功转入VHb基因的Tu6-VHb菌株在120 h内的最高酶活为40.23U/g，而Tu6菌株的最高酶活为24.45 U/g，说明Tu6-VHb菌株比Tu6菌株具有更强的产酶能力。Tu6-VHb菌株固体培养第72h时酶活达到最高，因此以Tu6-VHb菌株固体发酵72h为后续实验条件。

2.2 Plackett-Burman（P-B）试验设计及结果分析 用Design expert 8.0软件设计的P-B试验因素及水平见表1，P-B试验设计及纤维素酶滤纸酶活力的测定结果见表2，试验各因素分析结果见表3，各因素正负效应图见图2。

由图、表可知，按影响Tu6-VHb菌株固体发酵产纤维素酶的程度，各因素的重要性从高到低依次为碳源配比、初始pH值、氮源配比、初始含水量、吐温-80、接种量、发酵时间。其中，初始含水量、吐温-80、接种量、发酵时间影响为负效应，碳源配比、初始pH值、氮源配比影响为正效应。因此，确定碳源配比、初始pH值及氮源配比为最陡爬坡试验的重要因素。

表1 P-B试验设计各因素及其水平

表2 P-B试验设计及酶活测定结果

表3 P-B试验分析结果

图2 P-B试验各因数的正负效应图

2.3 最陡爬坡试验设计及结果 由P-B试验可知3个重要因素的影响均为正效应，因此设计各因素水平依次递增的最陡爬坡试验，试验设计及酶活测定结果见表4。

表4 最陡爬坡试验设计及结果

由表4可知，在最陡爬坡试验中，随着碳源配比、初始pH值和氮源配比各因素水平不断递增，相对应的酶活呈现先增大后减小的趋势。当碳源配比为3：1，初始pH值为5，氮源配比为1时，对应的酶活达到最高（121.51 U/g），可作为3因素响应的最大值区域。由此确定3因素最适水平，并以此设计后续响应面优化试验。

2.4 Box-Behnken（B-B）试验设计及结果

2.4.1 B-B试验设计 以3因素最适水平为中心值，设计响应面试验的3因素3水平，见表5。

2.4.2 B-B试验结果与分析 依据响应面试验设计进行固体发酵，以纤维素酶滤纸酶活力为指标进行分析。响应面试验设计及酶活测定结果见表6，试验结果分析见表7。

表5 B-B试验因素及其水平

表6 B-B试验设计及酶活测定结果

表7 B-B试验结果回归分析

由表7可知，该模型的相关系数R2=0.8841，说明88.41%的试验结果可由该模型解释，建立的模型较为准确；回归模型 P值=0.014 2（P＜0.05），模型显著。失拟性P值=0.0717（P＞0.05），失拟性不显著，模型没有失拟现象。模型的线性、平方的影响是显著的，交互作用影响不显著。

经过回归拟合后，得到回归方程：

酶活（U/g）=128.33-4.34×A-1.61×B-10.86×C-6.57×A×B-2.57×A×C-10.94×B×C-19.50×A2-13.00×B2-27.57×C2

式中，A为碳源配比，B为初始pH值，C为氮源配比。

根据该回归方程，当 A=2.89、B=5.02、C=0.90时，模型预测最大响应值R=129.61U/g。

2.4.3 响应面分析 根据响应面试验结果画出3个因素两两之间的响应曲面，其中曲面最高点表示酶活最大值；再绘出等高线密度图，根据等高线密集程度判断两因素对产酶的影响。

从画出的响应曲面图可知，当氮源配比为5.02时，碳源配比从2.00递增到4.00，初始pH值从4.50递增到5.50，测得纤维素酶酶活先增大后减小，二者交互影响，构成一个曲面，曲面最高点为酶活力最大值；当初始pH值为0.90时，碳源配比从2.00递增到4.00，氮源配比从0.50递增到1.50，测得纤维素酶酶活先增大后减小，二者交互影响，构成一个曲面，曲面最高点为酶活力最大值；当碳源配比为2.89时，初始pH值从4.5递增到5.50，氮源配比从0.50递增到1.50，测得纤维素酶酶活先增大后减小，二者交互影响，构成一个曲面，曲面最高点为酶活力最大值。

由等高线密度图观察可得，碳源配比的等高线密度高于初始pH值的等高线密度，表明碳源配比对Tu6-VHb菌株产纤维素酶的影响大于初始pH值的影响；碳源配比的等高线密度要高于氮源配比的等高线密度，表明碳源配比对Tu6-VHb菌株产纤维素酶的影响大于氮源配比的影响；初始pH值的等高线密度高于氮源配比的等高线密度，表明初始pH值对Tu6-VHb菌株产纤维素酶的影响大于氮源配比的影响。该结果亦与P-B试验的结果相一致。

2.4.4 模型验证 由响应面试验预测出Tu6-VHb菌株固体发酵产纤维素酶的最大酶活力为129.61 U/g。按照 A=2.89、B=5.02、C=0.90 进行 3组重复试验，取平均值得123.81U/g，与预测值相近，证明模型有效。由此，根据响应面优化得到Tu6-VHb菌株固体发酵产纤维素酶的最佳培养条件为：碳源配比（即麸皮与稻谷杆的比例）为2.89，初始pH值为5.02，氮源配比（即尿素与硫酸铵的比例）为0.90。

3 结论

用于优化发酵培养基的方法很多，如单因素法、正交法及响应面法。响应面法是一种考虑多因素交互作用并找到最佳组合及作用水平的优化法，是目前国内外常用的一种方法。

Tu6-VHb菌株由于向Trichoderma reesei中转入了VHb基因，增强了Tu6-VHb菌株的呼吸频率，促进了Tu6-VHb菌株在限氧条件下的生长繁殖，有利于Tu6-VHb菌株进行固体发酵产纤维素酶。Tu6-VHb菌株固体发酵产酶量较Tu6菌株提高了61%。在单因素优化的基础上，对Tu6-VHb菌株固体发酵产纤维素酶的培养条件进行了响应面法优化，最终得到最佳产酶条件为：碳源配比（即麸皮与稻谷杆的比例，固体发酵培养基总量为4g）为2.89，初始pH值为5.02，氮源配比（即尿素与硫酸铵的比例，Mandels营养液氮源添加总量为2.5g/L）为0.90。在此最佳条件下发酵产酶，每克培养基平均可产纤维素酶123.81U，比未优化前（每克培养基产纤维素酶40.23U）提高了3.08倍。