健脾化瘀方对肝癌HepG-2细胞生理活性的影响*

林泳欣，王昌俊

1广州中医药大学，广东 广州 510000；2广东省人民医院/广东省医学科学院

肝癌是我国常见的恶性肿瘤，目前对于肝癌的治疗以手术为主，但术后5年复发率高达70%。健脾化瘀方是导师根据“脾气亏虚，瘀血内结”理论结合名老中医钱伯文教授的临床经验总结而成，具有健脾益胃、化瘀散结等功效［1］。长期临床实践和实验研究［2-7］证明健脾化瘀方对肝癌有着良好的治疗效果。本研究主要观察健脾化瘀方对HepG-2细胞的侵袭力、转移和凋亡的干预作用，为健脾化瘀方治疗肝癌提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 人源肝癌细胞株HepG-2由广州中医药大学热带病研究所惠赠。

1.2 实验药物 健脾化瘀方(莪术12g，白术20g，茯苓20 g，苦参12 g，佛手12 g，白花蛇舌草15 g)购于广东省人民医院。

1.3 实验试剂 DMEM培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS)、0.25%胰酶均购于Gibco公司(美国)；青霉素G和链霉素、二甲基亚砜购于Sigma公司(美国)；CCK-8试剂盒购于jindo公司(日本)；TritonX-100购于Sanland化学公司；苏木素、伊红染液购于广州维伯鑫科技有限公司等。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 细胞于37℃、5%CO2培养箱中，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在培养瓶内常规单层传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1.4.2 药物提取与配制 用电热套加热回流提取法，按比例取生药910 g，加入10倍纯净水中浸泡 30分钟后，90～100℃提取 3次，1.5 h/次，冷凝管可回收莪术、白术、佛手挥发油。合并提取液，纱布过滤，合并2次滤液，混匀水溶性提取液与挥发油，在旋转蒸发仪上60℃浓缩至90 mL浸膏，再稀释成不同浓度的药液，存放于4℃冰箱中，抑菌备用。按《药理实验方法学》中人(70 kg)与小鼠(0.020 kg)体表面积折算等效剂量比值为0.0026，换算后确定健脾化瘀方低、中、高剂量分别为6.24、12.48、24.96 g/kg。

1.4.3 CCK-8检测细胞增殖 健脾化瘀方的工作浓度为16 mg/mL。将生长至80%～90%的HepG-2细胞用胰酶消化，离心后落板，每孔加细胞悬浮液100 μL，边缘空加 100 μL的 PBS避免边缘效应。24小时后用含不同浓度的含药培养基或新鲜培养基更换培养液，每个浓度平行设置3个复孔，留3个孔不加细胞悬液做空白对照，3个孔加细胞悬液不加药物做阴性对照。接着将培养细胞放入培养箱孵育48、72小时。将96孔板取出，用新鲜培养基更换所有旧培养基，每孔加10 μL的CCK-8。再将96孔板孵育2小时在450 nm的荧光下读取OD(optical density)值。该实验平行重复3次，得平均值用于实验结果统计。

1.4.4 细胞迁移实验(Transwell) 1)待对数生长期的HepG-2细胞长满瓶底80%后换无血清DMEM培养液饥饿8小时。2)调整HepG-2细胞密度为3.0×105个/mL，将transwell小室放入24孔板中，在transwell上室内加入50 μL细胞悬液，用无血清培养液配制对应健脾化瘀方药物组(按照CCK-8算出的IC50浓度)浓度药物，每上室分别加入50 μL含相同药物浓度培养液，每组设5个复孔，在transwell下室加入含30%胎牛血清的DMEM 培养液各 600 μL，置 37℃、5%CO2培养箱内培养24小时。3)将transwell小室取出，用棉棒将膜上表面未迁移的细胞小心擦去，下表面用10%甲醛固定30分钟，PBS漂洗后苏木素染色20分钟，PBS漂洗至无色。4)在倒置显微镜下观察、计数、拍照。

1.4.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况 1)取对数生长期HepG-2细胞离心，调整细胞数为每毫升2×106个，将细胞悬液接种于细胞培养瓶中，每瓶5 mL。实验分为：阴性对照组、健脾化瘀方药物组。按实验分组加入5 mL相应浓度的药物工作液(健脾化瘀方药物组浓度按照CCK-8计算得出的IC50浓度为准)，混匀后置37℃5%CO2、饱和湿度条件下分别培养24、48、72小时后，收集细胞，1 000 rpm/min，离心5分钟，弃上清，4℃PBS洗2次，再加入250 μL结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×106个/mL。2)将细胞培养液吸至合适的离心管中，PBS洗涤贴壁细胞1次，膜酶消化细胞(胰酶不含EGTA)，加入吸出的DMEM培养基中止消化。吹打下所有的贴壁细胞，吹散，收集至离心管。1 000 rpm离心5分钟。3)吸除上清，加入PBS重悬，再次l OOO rpm离心5分钟。4)弃上清，加1 mL冰浴预冷70%乙醇，吹打混匀，4℃固定2小时，l 000 rpm离心5分钟。加1 mLPBS，重悬细胞，再次离心，吸除上清。5)加入0.5 mL碘化丙啶(PI)，轻轻混匀，37℃避光温浴30分钟。6)进行流式细胞仪检测。

1.5 统计学方法 应用SPSS 12.0软件分析数据，计量资料以(±s)表示，两样本均数间比较采用独立分组t检验，多组之间数据分析采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健脾化瘀方对细胞增殖的影响 不同浓度的健脾化瘀方作用于HepG-2细胞48、72小时后，根据回归线性方程检测，得出48小时药物作用的IC50为12.15，72小时的IC50为9.75，且对于HepG-2细胞的抑制率差异具有统计学意义。根据预实验结果，HepG-2细胞和LO2肝细胞在作用72小时的IC50(半抑制浓度)上更加接近，故可选择健脾化瘀方作用72小时的IC50浓度作为后续实验的药物浓度，见表1。

表1 不同浓度健脾化瘀方作用48及72小时对细胞 HepG-2 增值的影响(±s，n=3)

表1 不同浓度健脾化瘀方作用48及72小时对细胞 HepG-2 增值的影响(±s，n=3)

注：对48小时与72小时2组不同药物浓度，采用回归线性方程检验，得出半数抑制浓度(IC50)

组别 48 h 72 h浓度20 0.9642±0.0297 0.9870±0.0272浓度15 0.9112±0.0328 0.7172±0.0493浓度10 0.4525±0.0935 0.4422±0.0369浓度8 0.2656±0.0253 0.2927±0.0054浓度5 0.1997±0.0840 0.2147±0.0501浓度2.5 0.0960±0.0259 0.1857±0.0315浓度0 0.0000 0.0000 R2 0.951 0.988 F 38.478 160.680 P 0.002 0.000 IC50 12.15 9.75

2.2 健脾化瘀方对HepG-2细胞迁移的抑制作用 药物作用24小时后，在倒置显微镜下随机选择2个视野，进行拍照，并通过Image Pro Plus 6.0软件计数。结果显示：与阴性对照组比较，健脾化瘀方药物组迁移率降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图 1、表 2。

图1 健脾化瘀方对HepG-2细胞迁移抑制作用(×10)

表2 健脾化瘀方对HepG-2细胞迁移的抑制作用

2.3 健脾化瘀方对HepG-2细胞凋亡的促进作用 与阴性对照组比较，健脾化瘀方有促进HepG-2细胞凋亡的作用，见图2、表3。

图2 健脾化瘀方对HepG-2细胞凋亡的流式细胞

表3 健脾化瘀方对HepG-2细胞凋亡的促进作用

3 讨论

手术是肝癌的主要治疗手段，根治性切除术后机体处于一种肿瘤休眠状态，即体内存在一些微量肿瘤细胞，在一定时间范围内没有被消除而潜伏，随着时间的推移及体内外因素的刺激会促使肿瘤复发和转移［8］，而肝癌的术后复发是导致患者死亡的最常见和最主要的原因，因此促进术后休眠，预防复发转移对于肝癌的治疗尤为重要。对于肝癌术后患者，针对体内潜伏着的微量肿瘤细胞，如果能有效控制甚至消除残存微量癌细胞，就能保持肿瘤处于休眠状态，延长生存期。癌细胞对机体产生伤害离不开其自身的增殖、侵袭、迁移的能力，若能抑制癌细胞以上能力，能在一定程度上延缓肿瘤对机体的侵害。研究显示健脾化瘀方中的白花蛇舌草能通过促进免疫因子的分泌增强免疫以消除肿瘤细胞［9］；莪术油能明显抑制肝癌细胞增殖［10］；苦参能增强对肝癌细胞增殖的抑制，促肝癌细胞凋亡［11］；茯苓多糖能增强机体的免疫应答［12］等。本研究发现健脾化瘀方能有效抑制癌细胞的增殖和迁移，降低侵袭能力，并能促使癌细胞凋亡，提示健脾化瘀方能有效减缓肝癌术后肿瘤的复发，可能是通过对机体内部残存休眠肿瘤细胞的抑制增殖及迁移能力，促进残存肿瘤细胞的凋亡，进而延缓肿瘤复发的进程，延长休眠期，保证了一定的生存时间。