脑心通胶囊对小鼠后下肢急性缺血模型抗炎作用研究

张璐莎，陈 璐，李春晓，尤星宇，房志锐，宋 敏，Joel Wake Coffie， 张丽媛，王 虹

(天津中医药大学天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，天津市中药药理学重点实验室，方剂学教育部重点实验室，天津 301617)

外周动脉疾病(peripheral artery disease,PAD) 是由于动脉粥样硬化导致周围动脉闭塞或狭窄而引起的缺血性疾病。据估计，全世界有超过2 亿人患有PAD，在老年人中发病尤其普遍，在55岁以上的人群中约有24%～32%患此病，患者运动能力明显下降，甚至面临截肢的危险，因此PAD是全球性的健康负担[1-3]。PAD是一种复杂的具有损伤性炎症反应的疾病，它包括激活免疫细胞的过度炎症反应以及促炎性细胞因子的释放，其将稳定斑块转化为易损的不稳定斑块，进而加重肢体缺血损伤，越来越多的证据表明，炎症在PAD的病理生理学中起到关键作用[4-5]。脑心通胶囊(Naoxintong capsule, NXT ) 由16味中药组成，具有活血化瘀、行气止痛之功效，是临床应用的大复方，其中丹参、当归、红花、赤芍具有活血化瘀功效，黄芪具有补气升阳、助血行气之功效，多个成分协同作用，最大限度地发挥各自的药理作用。NXT在临床上广泛应用于缺血性心脑血管疾病的治疗及二级预防，取得良好疗效，但其抗缺血组织损伤炎性反应机制尚不明确。本研究采用小鼠后下肢缺血(hind limb ischemia, HLI)模型，探讨NXT对外周缺血组织炎症反应的作用及其可能的作用机制。

1 材料

1.1实验动物52只SPF级健康ICR小鼠，♂，体质量 ( 30±2 ) g，8 周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK (京) 2012-0001。实验动物于天津市中国医学科学院生物医学放射工程研究所动物房中分笼饲养，自由进食，饲养温度(22～25)℃，相对湿度40%～60% 。

1.2药物与试剂NXT超微粉(陕西步长制药有限公司)。三溴乙醇(avertin，美国Sigma)；流式抗体PE anti-F4/80、APC-Cy7 anti-Ly-6G、PerCP anti-CD45 (美国Becton, Dickinson and Company，货号分别为565410、560600、561047)；0.9%氯化钠注射液(山东科伦药业有限公司)；实验用水为去离子水；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (货号：04897030001)、FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (货号：04913914001)，均购自美国Roche公司。

1.3仪器体式显微镜LEICA S8APO(德国Leica公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；64R型低温高速离心机(美国Beckman公司)；小动物手术器械包(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；COMPAC5小动物多功能麻醉机(美国VETEQUIP)；7500 Real-time PCR(美国Applied Biosystems)。

2 方法

2.1单侧后肢缺血模型(hindlimbischemia,HLI)的建立根据文献方法，建立小鼠单侧后肢缺血模型。在腹部侧面和腹股沟韧带表面形成5 mm的横向切口，以6/0号缝合线结扎动脉血管上下两端，在结扎线之间横切血管，缝合皮肤。术后血流量降低到术前的10%以下，且血流的频谱发生明显改变，以此作为后肢缺血模型成功建立的标准，然后将小鼠置于37℃电热毯上直至苏醒，不符合此标准的动物剔除。

2.2实验分组与给药按照随机双盲的方法，将动物分成3组：假手术组、模型组、给药组(模型+NXT 700 mg·kg-1·d-1)，每组16～18只。术后1 h，假手术组与模型组灌胃生理盐水0.01 mL·g-1，给药组灌胃NXT，每天1次，3 d后取材。

2.3流式细胞术鉴定中性粒细胞和巨噬细胞参考文献方法[6]，从小鼠腓肠肌中分离出白细胞，用相应的流式抗体标记后，采用流式细胞术检测中性粒细胞、巨噬细胞的阳性比例。

2.4定量RT-PCR法检测Emr1、TNF-α、IL-1βmRNA的表达使用TRIzol从小鼠腓肠肌中提取RNA，逆转录合成cDNA，使用FastStart Universal SYBR® Green Master (ROX) 进行qRT-PCR，检测Emr1 (F4/80)、TNF-α、IL-1β的表达。F4/80正向引物: 5′-CTGCACCTGTAAACGAGGCTT-3′, 反向引物: 5′-TTGAAAGTTGGTTTGTCCATTGC-3′；TNF-α正向引物: 5′-AGAAACACAAGATGCTGGGACAGT-3′,反向引物: 5′-CCTTTGCAGAACTCAGGAATGG-3′; IL-1β正向引物: 5′-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3′, 反向引物: 5′-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3′。

2.5蛋白芯片检测相关蛋白的变化依据蛋白芯片(R&D公司，货号：ARY028)说明书，进行后续操作。

3 结果

3.1NXT对HLI小鼠腓肠肌组织中中性粒细胞数目的影响构建小鼠单侧HLI损伤模型，术后d 3采用流式细胞术检测腓肠肌中中性粒细胞的数量。用Cell Quest软件建立获取模板 FSC/SSC双参数散点图，设P1门选定腓肠肌组织中除细胞碎片外的所有细胞为目的细胞 (Fig 1A )。建立分析模板APC-Cy7-Ly6G/PE-F4/80荧光双参数十字门散点图，横坐标代表PE-F4/80荧光强度，纵坐标代表APC-Cy7-Ly6G荧光强度，分析腓肠肌中中性粒细胞阳性细胞比例，中性粒细胞为表达Ly6G阳性、F4/80阴性的细胞，如Fig 1C Q1门所示。术后3 d(Fig 1B、1C)，与假手术组相比，模型组Ly6G+F4/80-细胞数量明显上调 (P<0.01)；与模型组相比，NXT组Ly6G+F4/80-细胞数量明显下调 (P<0.01)。结果提示，NXT在术后3 d时可以下调中性粒细胞的数量。

3.2NXT对HLI小鼠腓肠肌组织中巨噬细胞数目的影响术后d 3采用流式细胞术检测腓肠肌中巨噬细胞的数量，同样用Cell Quest软件建立获取模板FSC/SSC双参数散点图，设P1门选定腓肠肌组织中除细胞碎片外的所有细胞为目的细胞(Fig 2A)。再用该软件建立分析模板PerCp-CD45/PE-F4/80荧光双参数十字门散点图，横坐标代表PE-F4/80荧光强度，纵坐标代表PerCp-CD45荧光强度，分析腓肠肌中巨噬细胞阳性细胞比例，巨噬细胞为同时表达F4/80、CD45的双阳性细胞，如Fig 2C中Q2-1所示。术后3 d，与假手术组相比，模型组CD45+F4/80+细胞数量明显上调 (P<0.01)；与模型组相比，NXT组CD45+F4/80+细胞数量明显下调 (P<0.01)，可知NXT在术后3 d时可以下调巨噬细胞的数量(Fig 2A-2C)。Emr1基因是指征巨噬细胞的标志性基因，术后3 d通过qPCR方法检测腓肠肌中Emr1表达水平。结果显示：与流式细胞术结果一致，术后3 d，与假手术组相比，模型组Emr1 mRNA表达明显上调 (P<0.01)；与模型组相比，NXT组Emr1的表达明显下调 (P<0.01) (Fig 2D)。以上结果表明，NXT在后下肢缺血后3 d时可以下调巨噬细胞的数量。

3.3NXT对炎症信号通路中IL-1β、TNF-αmRNA表达的影响IL-1β、TNF-α是参与炎症的主要细胞因子，本研究通过qPCR方法检测NXT加药处理后腓肠肌中IL-1β和TNF-α的表达水平。Fig 3结果显示，术后3 d腓肠肌组织中，与假手术组相比，模型组IL-1β、TNF-α mRNA表达上调(P<0.05，P<0.01)；与模型组相比，NXT组IL-1β、TNF-α mRNA表达下调 (P<0.05，P<0.01)。 结果显示，NXT可以下调IL-1β、TNF-α的基因转录水平。

3.4NXT对炎症相关蛋白表达的影响为了进一步阐释NXT抗炎的作用机制，术后d 3取手术侧腓肠肌组织进行组织蛋白提取，利用小鼠细胞因子阵列试剂盒 (Proteome ProflerTMArray )进行检测。如Fig 4所示，Fig 4A黑色框中显示NXT给药后表达上调的蛋白，与模型组相比，NXT组表达上调的蛋白有CCL17、CCL22、白介素1受体拮抗剂(interleukin 1 receptor antagonist，IL-1ra)、IL-4、IL-13、IL-10，量化图见Fig 4B。其中，CCL17与CCL22是M2a型巨噬细胞的标志物[7-8]，IL-4诱导巨噬细胞向M2a型转化，M2a型巨噬细胞促进组织修复或组织重塑[9]。提示NXT治疗后，M2a型巨噬细胞的表达量较模型组增多可能与IL-4、CCL17、CCL22表达量增多有关。

Fig 1 Effect of NXT on neutrophil inhibition 3 d after HLI injury n=5～6)

Fig 4C黑色框显示NXT给药后表达下调的蛋白，与模型组相比，NXT组表达下调的蛋白7个，量化图见Fig 4D。其中，CCL5、CXCL9蛋白是M1促炎型巨噬细胞的生物标志[8]，参与调控白细胞的趋化活性及炎性反应等各种生理功能，TNF-α是体内重要的炎性因子，参与M1型巨噬细胞的转化[10]。NXT治疗后，CCL5、CXCL9、TNF-α等的表达量下降，提示NXT组M1巨噬细胞较模型组表达量降低。

3.5差异表达蛋白的生物信息学分析进一步对蛋白芯片结果进行分析，应用panther和string查询差异蛋白的功能及相互关系。Fig 5A显示差异蛋白所涉及到的信号通路主要有介导炎症的趋化因子和细胞因子信号通路、白介素信号通路，这些通路可能参与NXT抗炎药理作用的过程，同时提示NXT抗炎的作用机制可能与趋化因子和细胞因子信号通路介导的炎症反应相关。为了进一步研究蛋白之间的相互关系，通过string分析上调和下调的差异蛋白相互作用网络。结果显示：NXT加药处理后，表达上调的蛋白相互作用包括细胞因子-细胞因子受体之间的相互作用，以及IL-4、IL-13调节巨噬细胞的激活，即调节M2a的激活，如Fig 5B所示；NXT加药处理后，表达下调的蛋白相互作用包括参与炎症反应以及调节细胞分化，如Fig 5C所示，经过查阅文献，其中介导细胞分化的CCL5、CXCL9、IL-5、TNF-α参与M1型巨噬细胞的表达与募集。差异蛋白参与的通路以及相互作用进一步表明，与模型组相比，NXT组抗炎作用可能与M1型巨噬细胞表达减少，M2a型巨噬细胞增多有关。

Fig 2 Effect of NXT on macrophage inhibition 3 d after HLI injury n=5～6)

Fig 3 Expression of IL-1β and TNF-α mRNA in skeletal muscles down-regulated by NXT n=3)

4 讨论

本实验结果发现，NXT可以减少中性粒细胞以及巨噬细胞在损伤部位的积累，降低巨噬细胞标志性基因Emr1的表达，降低炎性因子TNF-α、IL-1β的表达，提示NXT能够降低缺血后肢的炎性损伤，为后续组织修复提供良好的微环境。蛋白芯片结果提示，NXT在后下肢缺血模型中降低炎症反应，可能是通过调节CCL5、CXCL9、IL-4、CCL17、CCL22等上下游蛋白，介导M1型巨噬细胞向M2a型巨噬细胞之间的转变来实现，后期本课题组将对以上假说进行进一步实验验证。

从炎症消退到组织修复的过渡阶段，炎性介质可能会随着血运重建，继续参与后续的修复反应。慢性炎症是血运重建中的关键障碍，其在外周动脉疾病中损害内源性血管再形成，并限制血运重建治疗的有效性，一些炎症介质的参与导致临床上治疗外周动脉疾病效果不佳[11]。由此可见，炎症与缺血性疾病有重要联系。

本实验结果发现，NXT可以降低损伤部位中性粒细胞的募集，当创伤发生后，最先到达炎症部位的有核细胞是中性粒细胞，中性粒细胞渗出血管并聚集到损伤部位，可通过释放细胞因子、蛋白水解酶等，引起机体正常组织的损伤，并可能延缓炎症反应的解决过程。 Kyriakides等[12]结果证明，中性粒细胞在骨骼肌损伤后还可以导致肌肉二次损伤，不利于肌肉再生。在后肢缺血模型中，NXT可以降低位于损伤部位的中性粒细胞数量，提示NXT可以降低中性粒细胞参与的炎症反应的发生。

Fig 4 Effect of NXT on related proteins 3 d after HLI injury (n=3)

同时发现NXT可以降低损伤部位巨噬细胞的募集，以及降低巨噬细胞的标志性基因Emr1的表达。研究显示[13]，巨噬细胞比率在伤后6～12 h，保持在较稳定的低水平，伤后1 d时迅速升高达到高峰值，伤后3 d急剧减少，但仍显示占有极少量的比率。如果巨噬细胞在损伤部位持续积累将会导致局部持续的炎症，组织损伤进一步加重，创伤修复就会明显延迟，甚至无法完成修复。Emr1(F4/80)基因是单核细胞从血液到达创伤部位获得的属于巨噬细胞的一种表型。本实验结果表明，在经历后肢缺血模型3 d时，NXT可以降低巨噬细胞在损伤部位的数量，降低巨噬细胞的标志性基因Emr1的表达，提示NXT可以降低巨噬细胞在损伤部位的积累，降低巨噬细胞参与的炎症反应的发生。

NXT可以降低炎性因子TNF-α、IL-1β的表达。TNF-α、IL-1β由促炎型巨噬细胞分泌产生，TNF-α在许多炎症性疾病中起关键作用；IL-1β是早期的促炎因子，IL-1β能够促进内皮细胞通透性的增加，刺激趋化因子的释放和大量黏附分子的表达，导致单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞向缺血区域的募集，扩大炎症反应导致进一步的损伤。本研究的蛋白芯片和qPCR结果共同表明，在后下肢缺血模型中，NXT可以降低TNF-α、IL-1β炎性因子的表达，提示NXT可以降低TNF-α、IL-1β参与的炎症反应的发生。

研究结果提示，NXT在组织缺血后通过调节巨噬细胞表型转变，抑制炎症反应的发生，与Wang等[14]的报道一致。此外，通过蛋白芯片与生物信息学分析发现，此转变可能与IL-4、CCL17、CCL22、CCL5、CXCL9、TNF-α参与的信号通路相关。体内M1与M2处于相对平衡的状态，研究证实巨噬细胞的损伤主要是由炎性M1巨噬细胞导致的，而替代激活的M2巨噬细胞是组织修复或重塑阶段晚期的主要影响因素[15]，M2巨噬细胞可分为M2a (IL-4/13激活型)、M2c (IL-10激活型)。综合蛋白芯片以及蛋白之间相互关系结果，提示在小鼠后下肢缺血后3 d时，NXT抗炎作用可能是通过诱导M1巨噬细胞转变向M2a型巨噬细胞来实现。

综上所述，NXT可以通过抑制外周缺血组织促炎因子的产生，调节巨噬细胞表型转化发挥抗炎作用，参与调节的蛋白包括CCL5、CXCL9、TNF-α、IL-4、CCL17、CCL22，涉及趋化因子和细胞因子调节信号通路。本研究证实NXT对于治疗外周动脉疾病具有一定的应用前景，但其作用机制还有待于进一步探讨。