醛糖还原酶AKR1B1与肺癌的相关性研究

孙基丰，孙婷婷，李超，金秀妍，张昊

（长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022）

醛糖还原酶AKR1B1蛋白（Aldehyde Reductase，AR）是醛酮还原酶（AKRs）超家族中的重要成员之一。它是NADPH依赖型的多功能酶类，蛋白的空间结构为一条含有巯基的单链的多肽，一般以单体的形式存在于生物体内[1-3]。醛糖还原酶（AKRs）超家族的许多成员都与人类的各种肿瘤疾病的发生发展密切相关。因此，醛糖还原酶超家族中的许多成员已经被作为肿瘤的诊断标志物被用于癌症的检测。还有一些成员是癌症潜在的诊断标志物，是目前科学界研究的热点[4]。

最近Ravinder等[5]发现：将醛糖还原酶小干扰RNA转入人大肠癌细胞能够抑制癌细胞的生长，表明醛糖还原酶可能在促进癌细胞生长中起重要作用；而在肾上腺皮质癌时醛糖还原酶表达下调，可以作为肾上腺癌的候选诊断标志物[6]。还有研究表明抑制醛糖还原酶可以抑制肿瘤坏死因子α（TNFα）诱导的血管平滑肌细胞的增殖，激活核转录因子κB可能是其机制之一[7]，因为醛糖还原酶参与血管平滑肌细胞增殖，可能参与血管重塑[8]。醛糖还原酶除了促进血管平滑肌细胞增殖外，还可以促进肾脏系膜细胞的增殖[9]，醛糖还原酶抑制剂能改善内皮细胞功能[10]。越来越多的证据表明：多种存在氧化应激的心血管疾病如动脉粥样硬化、心肌缺血、血管再狭窄、心力衰竭和血管炎等都有醛糖还原酶的参与[11-15]。醛糖还原酶AKR1B1的活性还与糖尿病并发症包括白内障[16]、视网膜病变[17]、神经病变[18]和肾病[19]存在因果关系。而糖尿病的多种慢性并发症被认为是糖尿病致死、致残的主要原因。

本文主要对人源醛糖还原酶AKR1B1进行密码子优化，使其在原核大肠杆菌中表达。制备醛糖还原酶AKR1B1多克隆抗体，建立ELISA方法，绘制标准曲线。利用实时荧光定量PCR技术和ELISA检测技术，在分子和蛋白水平上对AKR1B1蛋白在肺细胞MRC-5和肺癌细胞A549表达进行检测与比较分析。为进一步探索AKR1B1在人类肺癌中的发生发展提供理论基础。

1 实验材料

1.1 质粒菌种及细胞

质粒 AKR1B1-pET15b、菌种 E.coli DH5α和BL21（DE3）、MRC-5肺细胞、A549肺癌细胞由本实验室保存。

1.2 实验动物

清洁级BALB/c小鼠（18-22g，4周龄，雌性，5只）从长春市亿斯实验动物技术有限公司购入。

1.3 实验试剂

BCA蛋白定量试剂盒、细胞总蛋白提取试剂、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司；（去基因组）cDNA第一连合成试剂盒、总蛋白提取试剂盒（离心柱型）、SuperReal荧光定量预混试剂增强版（SYBR Green）均购自北京天根生化科技有限公司，其他药品均为分析纯。

2 实验方法

2.1 重组蛋白的预表达及可溶蛋白制备

将重组质粒pET-AKR1B1和pET 15b空载体分别诱导表达，37℃温度，OD600为0.6时，IPTG诱导5h，总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。蛋白表达条件进行优化，在最佳条件下大量培养重组菌，并进行目的蛋白组氨酸柱纯化，收集可溶性人醛糖还原酶AKR1B1蛋白，利用考马斯亮蓝G250法测定目的蛋白含量。

2.2 AKR1B1蛋白多克隆抗体的制备及ELISA检测

在第一次免疫小鼠之前，对小鼠断尾取血，低温离心收集血清，作为阴性血清备用。利用制备的人醛糖还原酶AKR1B1蛋白腹腔注射免疫4只BALB/c小鼠，每周免疫1次，共免疫3次。最后一次免疫一周后，摘除小鼠眼球取血，室温放置2-3h，低温离心分离血清，间接ELISA方法测定抗体效价，-80℃储存备用。

2.3 肺细胞及肺癌细胞培养及BCA法检测

将培养制备好的实验用细胞，使用PBS冲洗细胞，放入5-7倍的萃取试剂，并进行多次的吹吸混匀。10000-14000rpm离心10min取上清。配制BCA工作液。抽取试剂标准稀释液和未知的样液150μL至孔板上。在各个孔中滴入150μL的BCA，充分混合，置于37℃培养箱中培养2h。使用酶标仪测量562nm下的OD数值，取平均数计算浓度。

2.4 AKR1B1在细胞中mRNA水平的鉴定

选取对数生长期的细胞进行培养，使用天根公司的总mRNA提取试剂盒提取总mRMA，电泳鉴定。借助FastQuant系列的cDNA第一链合成试剂盒，进行总RNA反转录实验。

3 结果与分析

3.1 重组蛋白的预表达及条件优化结果

3.1.1 表达载体的鉴定

对重组表达菌株AKR1B1-pET-15b-BL21（DE3）构建成功后，提取质粒DNA，进行一步电泳鉴定，结果表明重组质粒条带明显高于对照质粒大小如图1所示（2-10泳道）；进一步双酶切鉴定，结果表明重组质粒含有目的基因，大小在1000bp左右，如图2所示（2泳道）。

图1 AKR1B1-pET-15b一步鉴定图1：pET-15b质粒；2-10：AKR1B1-pET-15b；11：DNA Marker DL15000

图2 酶切鉴定图

3.1.2 重组蛋白预表达

对诱导表达后的总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳检测分析，如图3所示，通过重组菌株AKR1B1-pET-15b-BL21（DE3）表达结果与空菌pET-15b-BL21（DE3）表达结果对比发现，在大约35.4KDa位置处，重组菌株总蛋白条带中有一条清晰的蛋白条带，成功表达了目的蛋白人醛糖还原酶AKR1B1（2-3泳道）。

图3 人醛糖还原酶AK蛋白预表达图

3.1.3 人醛糖还原酶AKR1B1蛋白表达条件的优化结果

经过优化的重组蛋白表达条件为：IPTG诱导剂浓度为：1.0mmol/L，诱导表达温度为：16℃，诱导时间为：24小时，培养箱转速为：110rpm。在最优条件下，上清中可溶蛋白表达最好，通过Ni-NTA亲和层析柱纯化，蛋白电泳结果显示目的蛋白在大约35.4KDa处。

图4 1：低分子量标准蛋白质marker 2，3：人醛糖还原酶AK蛋白

3.1.4 AKR1B1重组蛋白浓度的测定

利用考马斯亮兰G-250法测定目的蛋白浓度，标准曲线为y=8.9929X+0.0269，R2=0.9914，测得目的蛋白的OD595nm值为0.367，蛋白含量为1.9mg/ml，如图5所示。

图5 考马斯亮蓝50法测蛋白含量建立标准曲线图

3.2 AKR1B1蛋白鼠多克隆体效价及最佳稀释倍数

血清效价测定结果如下表1所示：抗体最高效价为32000。

表1 血清效价测定数据

3.3 BCA法定量检测细胞中总蛋白含量

BCA法标准曲线为y=0.0003X+0.0924，R2=0.9962如图6所示，由BCA试剂盒测得提取的蛋白在稀释10倍的情况下，人肺细胞MRC-5 OD值为0.124，人肺癌细胞A549为OD值0.132。由标准曲线计算得到人肺细胞MRC-5的蛋白含量为1053μg/ml，人肺癌细胞A549蛋白含量为1320μg/ml。两种细胞表达量看，人肺癌细胞A549的目的蛋白表达量远大于人肺细胞MRC-5的蛋白表达。

图6 BCA法定量检测细胞总蛋白含量标准曲线

3.4 两种细胞中目的蛋白含量测定

用原核表达的人醛糖还原酶AKR1B1蛋白为抗原建立了ELISA标准曲线，该标准曲线y=0.1811ln(x)-0.2817，R2=0.9715，如图7所示：

图7 标准曲线

（2）两种细胞中人醛糖还原酶AKR1B1含量对比如图8所示，人肺细胞MRC-5和人肺癌细胞A549中目的蛋白含量分别为：0.82μg/mg，2.41μg/mg，实验结果显示人肺癌细胞A549中目的蛋白的含量约为人肺细胞MRC-5中的3倍。

图8 两种细胞中目的蛋白含量对比

3.5 cDNA鉴定结果

分别以MRC-5细胞和A549细胞的cDNA为模板，利用普通PCR反应对设计的AKR1B1引物的特异性进行验证，结果如图所示，PCR条带单一且均在实验预期的大小范围之内，说明AKR1B1的引物特异性达到实验要求，可用于实时荧光定量PCR实验。

图9 AK引物特异性验证：1；DNA Marker D000 2-3；49细胞cDNA PCR结果4-5：MRC-5细胞cDNA PCR结果

3.6 实时荧光定量PCR结果

实时荧光定量PCR的检测结果如图11和图12所示，图10是目标基因的扩增曲线，图11是溶解曲线。显示：在PCR过程中未发生非特异性扩增，实时荧光定量PCR的结果可信。

图10 实时荧光定量PCR扩增曲线图

图11 实时荧光定量PCR溶解曲线图

运用2-△△CT的数据分析方法对获得的实验数据进行处理，结果如表2所示。以MRC-5细胞中AKR1B1的表达量为参照因子，A549细胞中目的蛋白含量为MRC-5细胞中的4.1倍。

表2 实验数据处理结果

4 讨论

本文成功构建了AKR1B1-pET-15b-BL21（DE3）重组表达菌株，表达条件（IPTG浓度、诱导时间、诱导温度）进行了优化，当IPTG浓度为1mmol/L，诱导时间为24h，诱导温度为16℃，可溶性蛋白表达最好。

利用原核表达得到的人醛糖还原酶AKR1B1蛋白免疫小鼠，获得了多克隆抗体，抗体效价为1∶32000。

本文成功在体外培养了人肺细胞MRC-5，人肺癌细胞A549。通过间接ELISA实验在蛋白水平上对人醛糖还原酶AKR1B1蛋白在两种细胞中的表达进行了检测分析。结果显示：人肺细胞MRC-5和人肺癌细胞A549中AKR1B1蛋白的浓度 分 别 为 0.81μg/mg，2.41μg/mg。 人肺 癌细 胞A549中AKR1B1蛋白的含量约为人肺细胞MRC-5中的3倍。

通过实时荧光定量PCR试验，结果显示，在mRNA水平上人肺癌细胞A549中AKR1B1的含量为人肺细胞MRC-5中的4.1倍。

本文通过间接ELISA实验和实时荧光定量PCR实验结果分析看，人醛糖还原酶AKR1B1蛋白在肺癌中确实存在过度表达，这提示我们，人醛糖还原酶AKR1B1蛋白在人类肺癌的病理过程中发挥作用。但是该酶发挥作用的机制还不清楚，是该酶代谢失调导致癌细胞的发生，还是由于癌细胞的产生导致该酶大过量表达，还有待于进一步研究。本文研究结果AKR1B1在肺癌中的作用机制提供理论及实验技术基础。