笋用竹正常植株和病害植株根际微生物的分析

骆栋卿

(广西壮族自治区国有高峰林场，广西南宁530001)

笋用竹不仅是绿色资源，还可以应用到保健药物中，成为保健食品。在现代生活中，加工笋用竹已成为新时期中的新型行业。目前，我国笋用竹生长对地域与季节有较高的要求，如果在淡季种植笋用竹，那么好的竹笋与笋用竹便会有所减少，因此，在竹笋种植的过程中，应加强生理上的特性，加强对淡季竹子和生态环境的分析。以此为今后的研究提供有效的理论依据。

本次研究的目的是分离和鉴定具有病害和正常竹笋根际微生物，比较两者检验出的结果，为竹笋的种植和病害防治提供参考资料。

1 笋用竹正常植株和病害植株根际微生物的实验研究

采样点选择的地点是广西大学林学院，为亚热带季风湿润的气候地区，此地域年平均气温为21.9℃，最高温度是29℃，最低气温是-12.7℃，平均年降水量是1411.4mm，无霜期平均湿度在80%以上，年日照时间为1717.35h。竹园植被覆盖率为85%，此竹园里种植多种竹子，如青竹、四季竹、慈祥竹、绿竹、佛肚竹等。

2 一般材料与方法

2.1 一般材料

试验材料均为二年生的笋用竹。正常植株高为3.5m左右，直径为3.1cm左右，叶子的颜色属于深绿色。病株高为2.8m，直径在2.5cm。大部分叶子都会出现枯萎等症状，并且仔细观察可以从叶柄处看见白色的害虫。

2.2 方法

2.2.1 采样方法

从东、南、北、西4个方向挖掘出竹根表层土壤，在10 An深度处可以发现竹根。从竹根的末端和中部段切断。直径为9mm，厚度为4mm的土壤。

“Ⓒ”代表普通植物， “＠”代表病株， “®”代表竹园的空地，奇数表示根的末端，偶数表示根的中间”，并对收集到的土壤进行编排。表1展示所有的情况。在实验的过程中，应戴上无菌乳胶手套，将土壤揉成小于2mm的土样，放入牛皮纸样袋中，最后存放于4℃冰箱中，以便日后使用。

表1 植株采样对比表

2.2.2 样品处理

Ⓒ1、Ⓒ3、Ⓒ5、Ⓒ7的平均混合为1(以下4组样品以相同的方式混合)，Ⓒ2、Ⓒ4、Ⓒ6、Ⓒ8。＠1、＠3、＠5、＠7为3号；＠2、＠4、＠6、＠8为4号；®1、®2为混合性5号。

2.2.3 微生物种群的分离

从编号为1/2345的5份样品中取出14g样品，分别放入装有150mL无菌水的三角瓶中，固定棉花塞，振动30min无菌操作，1mL稀释成为5个数量级，稀释10、10、10、10、10∗，并将Q1mL分别用在3种细菌和真菌培养上。细菌培养基和真菌培养基分别在34℃、27℃恒温培养箱中培养满24h后进行观看。

2.2.4 微生物种群的纯化

培养24h后，选择不同菌落并接种到培养基中。在恒温条件下振荡培养6h后，细菌按照规定的程序再次进行分离培养，直到平板上的所有菌落与肉眼没有明显差异。然后单一菌落在培养基中培养6h，将液体在斜面上孵育24h，然后保存在冰箱中，防备日后使用。

2.2.5 微生物的分类鉴定

生理生化鉴定方法：描述第1批分离菌落 (平涂24h)的形态，包括菌落大小、形状边缘、突起、干燥、透明质、颜色以及菌落数量，并在诸多菌落中识别出相同或相似的菌落。

革兰氏染色：培养6h，将细菌环固定在玻璃玻片上，用1 min的洗涤碘染成结晶紫，放置在空气干燥的地带，用脱色液洗净30次，在此渲染洗干2min。以致显微能够观察到颜色的形态。

孢子染色：培养24h后取菌液，并固定在玻璃玻片上，饱和孔雀石绿色染色10m再洗干，直到菌丝体呈红色孢子呈绿色为止。

暴露酶实验：分离培养24h的细菌液体，用3%过氧化氢涂抹在玻片玻璃上，观察是否产生气泡。

半固体培养基穿刺培养：将细菌液体接种于半固体试管培养基中，接种环6h，培养24h，最后观察细菌是否产生了扩散的迹象。

明胶反应：在明胶培养基上接种30h后，培养6d以后，观察明胶液化是否发生了变化。

耐盐板：在不同浓度的盐板上培养24h后，观察细菌在室温下的生长情况。

3 结果与分析

3.1 不同植株的根际微生物数量

根际土壤样品在选择性细菌培养基和真菌培养基后。培养出的基稀释涂布盘 (细菌10倍，10倍的真菌)，以及不同植物根际微生物在培养皿中形成的菌落如图1所示。

图1 不同植株的根际微生物数量图

同时，在此对不同形态的菌落进行分离纯化。结果表明根部微生物数量多于根部数量，因此得出笋用竹微生物最多的部位是根部；病害植物根际微生物数量比正常植物中的微生物较多；根际微生物数量少于对照土壤；平均土壤中根际细菌的ER为1×10 CFU；竹笋根际真菌平均数量为9.4×10 CFU，统计结果见表2。

3.2 不同植株的根际微生物种群

3.2.1 细菌初步鉴定及种群的比较

通过菌落形态鉴定、形态分类、革兰氏菌、明胶液化、接触菌的鉴定中，可以初步鉴定正常笋用竹与病株竹笋根际微生物的类型。198株细菌中从正常植物根际土壤中可以分离出6属，229株细菌可以从病株根际土壤中分离出8属。其中，芽孢杆菌、变形杆菌、农杆菌属优势种群，Bocholderia病株是根际微生物所存有的一种菌属。与正常植物根际细菌相比，病株根际细菌数量较多，病菌的群体也比较广泛，有可能与正常植物的抵抗作用能力有着密切的联系。

表2 笋用竹正常植株与病害植株的根际微生物的数量

表3 笋用竹正常植株与病害植株的根际细菌种类及数量(菌株数·株-1)

3.2.2 真菌初步鉴定及种群比较

以孟加拉红和链霉素为筛选剂。根据菌落、细胞形态和孢子的特征，初步对菌类进行鉴定，结果表4所示。48种真菌可以从正常植物根际土壤中分离出4个属。而从60种真菌可以从病株根际土壤样品中分离出6属，表格中明显表示了这几个种属。表4中的毛霉、青霉、曲霉和酵母菌属于相同属，每个属种基本都相同；正常植物根部真菌的数量比根部中间的真菌较多，病株根部和根部中部的真菌数量是相同的，其中的因素有可能是因为植物的健康与外界的干扰因素有较大的关系；Puccinia phyllostachys和普通镰刀菌是病害植物根际土壤中特有的一种。

表4 笋用竹正常植株与病害植株的根际细菌种类及数量(菌株数·株-1)

3.2.3 致病微生物的分析

普通变形杆菌、Bockhord nion Puccinia mongolica和Fusarium vulgaris都被称为致病菌，但普通变形杆菌Bockholderia cepacia一般病菌都会出现在小动物身上，没有相关植物感染的报告。因此，普通变形杆菌、头孢菌素并不是是竹笋致病菌。感染病害的笋用竹茎有黑点、叶柄粉状、叶片呈黄色、根系统也有黑斑、EM明显变短、整体会慢慢腐烂，最后部分死亡。因此，根据以上状况可以判定该植物应感染了Puccinia phyllostachys和普通镰刀菌。

4 小结与讨论

从正常植物根际土壤中分离到198株细菌和48株真菌，从根际土壤中分离到229株细菌与60株真菌。其中，芽孢杆菌与农杆菌属是常见群体，变形杆菌和Bockholdsp是病株根际微生物特有的两种菌类。而属毛霉、青霉、曲霉和酵母菌中的每个属的数目基本相同。锈菌属和镰刀菌属是病害植株植物根际土壤特有的物种。

与笋用竹正常植株根际微生物相比，病株根际微生物数量较多，种族比较广，产生此原因有可能与正常植株根际微生物抵抗作用有关。根部末端的微生物数量比根部、中部的微生物数量较多。笋用竹正常植株细菌在土壤中根际细菌的平均数为1.1×10 cfu，而真菌平均数为9 4×10 cfu。

通过对平板菌落数和菌落特征的描述，发现在病竹中培养根际微生物数量比正常笋用竹植株菌数较多，可以看出根际土壤中的微生物可以在植物根周围形成保障区。在此种微生态环境下，保护植物根系可以有效降低病菌与害虫侵犯的次数，因此，植物根际微生物的研究是研究防治植物微生物细菌的基础。此外，在细菌研究的结果中还发现了RHI中的主要细菌。相关研究结果表明，芽孢杆菌对水稻纹枯病和番茄青枯病有一定的影响，而芽孢杆菌对植物病原具有较强的拮抗能力与广谱。这些微生物作为本地微生物，与植物双方有一定的影响作用机制，了解和理解这些菌株之间所存在的关系以成为现代科学研究的一个热点话题之一。

在此鉴定中，检测细菌的种类通常应用形态学观察法进行鉴别，包括革兰氏的运动观察等方法。对生理和生物进行了厌氧、好氧、完全培养基和基础培养基培养、生物降解性试验等化学实验。对16 sddna序列进行了扩增，进行测序，并将检测到的序列与GenEbank中的细菌序列进行比较。在正常的情况下，同源性在90%以上就可以确定细菌的属性，但无法辨别出细菌的种类。由于本实验提供了足够的实验数据，在物种鉴定方面具有较高的可靠性。