荔波唇柱苣苔种子诱导组织培养和快速繁殖

玉屏 王万海 熊志斌 王莲辉

(1.贵州茂兰国家级自然保护区管理局，贵州荔波558400；2.贵州省林业科学研究院，贵州贵阳550005)

引言

荔波唇柱苣苔 (Chirita liboensis)为苦苣苔科(Gesneriaceae)唇柱苣苔属 (Chirita)多年生草本植物，仅产于贵州荔波，为荔波特有种。荔波唇柱苣苔生于石灰岩地区低山林下阴湿处石上，是适应于石灰岩碱性生长环境的喜钙植物，具有明显的石生性和喜钙性，对生长有较为严格的专一性，且种群植株数量一般较少。荔波唇柱苣苔还具有较好的观赏性，其花色蓝中带紫，紫中有蓝，花朵较多，叶片大，叶脉银色，适宜于室内盆栽观赏。

该物种因长在深山无人识，未能得到较好的开发利用，为达到商品化生产和保护野生资源的作用，本文以荔波唇柱苣苔的果实为外植体，进行无菌播种开展组培试验，筛选最适合播种诱导、增殖分化、生根培养基，研究荔波唇柱苣苔快速繁殖技术，为荔波唇柱苣苔规模化培育开发利用提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选用茂兰喀斯特地区生长的野生荔波唇柱苣苔果实作为组培外植体，所选的果实长势优良，无病虫害。种子采摘后立即带回实验室进行组织培养等研究。

1.2 试验方法

将采集的荔波唇柱苣苔果实，用洗衣粉溶液洗去外表污染物，然后用流动自来水反复冲洗干净备用。在超净工作台上将洗净的果荚用75%酒精溶液灭菌30S后用无菌水冲洗3次，然后用0.1%HgCl2溶液振荡5min，最后用无菌水反复冲洗5～6次，放在无菌纸上吸干果实表面水分。将消毒好的荔波唇柱苣苔果实用消毒剪刀将一端剪开一小口，轻轻抖动果实把里面的种子均匀播散在培养基上。

所有培养基均添加4g/L琼脂和20g/L蔗糖，pH值调节为5.4～5.8。接种后培养条件为：温度 (25±3)℃， 光照强度 30～40μmol·m-2·s-1， 光照时间12h/d。

1.3 诱导种子萌发

将消毒好的种子均匀播种于MS基本培养基上，进行无激素添加培养与附加不同激素浓度配比的培养基进行诱导种子萌发对比试验。设计NAA浓度为0.1mg/L， 6-BA 浓 度 为 0.1、 0.5、 1.0、 1.5、2.0mg/L5个浓度梯度。每个处理10瓶，每瓶播种3团，每个处理重复3次。45d后，观察种子萌发的情况，统计萌发率。萌发率＝萌发团数/接种团数×100%

1.4 原球茎增殖分化的培养

将萌发出的原球茎和小芽接种于添加不同浓度6-BA的MS基本培养基上进行培养。设计NAA浓度为0.1mg/L， 6-BA 浓度为 0.1、 0.3、 0.5、 0.8、 1.0、1.2、1.3、1.5mg/L8个浓度梯度。每个处理10瓶，每瓶接种3团原球茎和小芽，每个处理重复3次。30d后观察增殖情况，统计增殖倍数。

1.5 壮苗生根的培养

等分化出的植株生长出3～5片叶的时候，将单株小苗接种到 NAA浓度为 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L5个浓度梯度的MS培养基上。每个处理接种10瓶，每瓶接种1株小苗，每个处理重复3次。观察小苗生根情况并计算生根率。生根率＝生根瓶数/接种瓶数×100%。

1.6 数据处理方法

用Excel 2007进行数据统计处理，用SPSS18.0软件对试验数据进行单因素方差分析，差异显著的采用多重比较。

2 实验结果与分析

2.1 激素的添加对种子萌发的影响

荔波唇柱苣苔接种于表1所示的培养基上，45d后6个处理均有种子萌动形成原球茎。

根据方差分析及对不同试验处理进行多重比较后，结果表明 (表1)不同浓度激素处理对荔波唇柱苣苔种子萌发的影响表现差异显著。当6-BA浓度低于0.1mg/L时种子萌发率开始降低，以不添加激素萌发率为最少。当6-BA浓度大于1.0mg/L时种子萌发出现膨大，随着激素浓度增高，膨大现象越严重。经过统计，其中以处理3为最佳，萌发率达98%，萌发原球茎疏松呈绿色。15d后，新芽数量逐渐增多，出现少量小芽展出2片真叶的幼芽。

2.2 不同激素浓度组合对原球茎和小芽增殖分化的影响

将初代培养形成的原球茎和小芽分别转接到MS为基本培养基的增殖培养基上，研究不同激素配比对原球茎和小芽增殖的影响。

根据方差分析及对不同浓度激素处理进行多重比较分析，结果显示 (表2)不同浓度激素处理对荔波唇柱苣苔增殖分化的影响表现差异不显著。不同浓度值激素对原球茎和小芽均有增殖，增殖的数量虽然无明显差异，但随着6-BA浓度的升高分化出的小苗逐渐出现叶片卷曲，苗丛密集，过度微型化等现象，有部分叶片出现白化透明状态。经过对比，当6-BA浓度为0.1mg/L时为最佳，增殖倍数高，形成植株形态快，且数量多。30d后，分化的原球茎和小芽形成植株形态，具有3～5片叶，叶片呈现绿色叶面上被白色绒毛，有少量白色须根出现。

表1 不同浓度激素处理对种子萌发率的影响

表2 不同浓度激素配比对增殖分化的影响

2.3 不同浓度NAA对荔波唇柱苣苔生根的影响

将分化生长出4～5片叶以上的植株接种于MS基本培养基上，添加不同浓度的NAA(见表3)作为生根培养基诱导无菌苗生根。从表3可知，荔波唇柱苣苔生根较容易，不同浓度的激素下均能生长出根。但随着NAA浓度升高，植株茎干生长较快，约能长出3个节间茎段但较脆弱，不利于出瓶栽培。经观察，当NAA浓度为0.5mg/L时生根状况和植株状况为最佳，在小苗底部四周逐渐长出数条白色的细根长约0.5～1.5cm，45d后白色细根颜色逐渐变深变长约3～5cm左右，叶片变大变宽，长约3cm以上，宽约2～3cm，颜色呈深绿色，叶片被白色绒毛，生长健壮。

表3 不同浓度NAA对生根的影响

2.4 荔波唇柱苣苔的炼苗与移栽

组培瓶苗的健壮度与移栽后的管理对苗的成活具有很大的影响。选择生长健壮的荔波唇柱苣苔植株开口炼苗后，将其栽培于消毒发酵好的锯木面中，温室内培养30d后将小苗移到室外，放置在散射光照条件下培养，每天进行喷雾保湿。荔波唇柱苣苔组培苗经炼苗后，室外移栽成活率达85%以上。

3 结果与讨论

本文以通过对荔波唇柱苣苔种子进行无菌萌发诱导、增殖分化和生根培养的方式进行研究，建立了荔波唇柱苣苔组织培养快速繁殖体系。

结果表明：在设计的培养基中，种子萌发培养基为MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA；继代增殖分化培养基为MS+0.1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA；生根壮苗培养基为：MS+0.5mg/LNAA。以上培养基均添加4g/L琼脂和20g/L蔗糖，pH值调节为5.4～5.8。

4 意义与进展

荔波唇柱苣苔是荔波特有种，属于狭域性分布的类群，稀有性明显，无论在科学研究上还是在物种保存上都有重要意义。荔波唇柱苣苔利用种子开展的组培培养和快速繁殖尚未见报道。