壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒的制备及其对冷藏草鱼蛋白氧化的影响

2018-12-15武苗苗李晨辉董汝月于晓倩刘尊英

中国渔业质量与标准 2018年6期

武苗苗，李晨辉，董汝月，于晓倩，刘尊英

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003)

草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是中国重要的淡水鱼之一，也是中国著名的“四大家鱼”之一[1]。根据《2017年中国渔业年鉴》统计，目前中国草鱼养殖年产量约为589.88万t，是中国动物蛋白的主要来源之一[2]。草鱼蛋白质和氨基酸含量丰富，具有较高的营养价值。但是如若在贮藏与运输过程中处理不当，在微生物与组织蛋白酶的作用下，鱼肉蛋白极易发生氧化变性导致蛋白功能性的降低，如蛋白可溶性、凝胶力、持水力下降等，从而导致鱼肉品质发生劣变[3]。低温冻藏技术作为水产品常用的保鲜技术可以有效地抑制微生物的生长繁殖，降低内源酶的活性，但是在冻藏过程中形成的冰晶能够造成肌肉组织的机械损伤，影响水产品品质。目前草鱼保鲜常添加合成抗氧化剂，如二丁基羟基甲苯(BHT)、特丁基对苯二酚(TBHQ)等,由于大量使用会有一定的副作用，因此开发使用天然抗氧化剂保鲜草鱼非常必要。

迷迭香提取物是从迷迭香中提取的一种粉末状物质，因含有多种具有生物活性的化合物(如鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸和迷迭香酚等)，而成为一种安全、天然、高效的抗氧化剂，已被应用于食品领域[4]。然而，迷迭香提取物的水溶性较差，限制了其抗氧化活性。有研究表明，壳聚糖所形成的纳米粒载体，因具有水溶性、低毒性、生物降解性、生物相容性、易组装性和控释等特点，已在食品医药领域得到了广泛应用[5]。因此，本研究试以壳聚糖为载体，制备壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒，并将其应用于草鱼保鲜中，探究其抗氧化活性及对冷藏草鱼蛋白氧化的影响，为草鱼的保鲜提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料主要包括：草鱼(购于青岛某水产市场)；迷迭香提取物(rosemary extract, RE，99.6%鼠尾草酸，成都生物化学物质有限公司)；壳聚糖 (chitosan, CS, MW 30-35 kDa)；卵磷脂(lecithin, LC，Sigma-Aldrich化工有限公司)。使用仪器设备包括：DF-101S恒温加热磁力搅拌器 (郑州长城科工贸有限公司)；GL-21M 高速冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；UV-2550 紫外分光光度计(岛津仪器分析有限公司)；Sygerny多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)；PSX 智能生化培养箱(宁波东南仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒的制备

称取一定质量的壳聚糖粉末，溶解于0.275 mol/L的HCL溶液中, 添加1.5% (m/V)的吐温-80，形成1% (m/V)的壳聚糖溶液。磁力搅拌后用0.45 μm微孔滤膜过滤备用。卵磷脂溶入无水乙醇中，超声进行溶解，得到质量浓度为25 mg/mL的乙醇卵磷脂溶液。取配好的壳聚糖溶液，加入蒸馏水稀释并置于磁力搅拌器上，以每秒2～3滴的速度加入不同体积的卵磷脂溶液，形成不同质量比的壳聚糖纳米溶液，在700 Hz下超声15 min。

选取卵磷脂/壳聚糖的比重为10∶1(m/m)制备壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒。取不同质量的迷迭香提取物粉末，溶解于2 mL的乙醇卵磷脂溶液中，然后用无菌注射器将其逐滴加入到稀释好的壳聚糖溶液中并用磁力搅拌器搅拌，之后在700 Hz下超声15 min，得质量浓度分别为0.3、0.6、0.9和1.2 mg/mL的壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒溶液。

1.2.2 迷迭香提取物纳米粒的表征

1)平均粒径、表面电位的测定。用纳米粒度分析仪测定壳聚糖-迷迭香提取物纳米粒的平均粒径、表面电位。测试温度为25 ℃，测试角度为90°，平行测定3次。

2)标准曲线的测定。精确称取一定质量的迷迭香提取物粉末，用25 mg/mL乙醇卵磷脂溶液分别配成质量浓度为0.025、0.05、0.10、0.15和0.20 mg/mL的迷迭香提取物溶液，在283 nm处测定其吸光度值。分别以迷迭香提取物浓度和吸光度值为横纵坐标绘制标准曲线。

3)壳聚糖-迷迭香提取物纳米粒的体外缓释性能。根据全国芬[6]的方法测定。

1.2.3 体外抗氧化活性测定

DPPH自由基清除率根据Kumari等[7]的方法比较测定。ABTS自由基依据Zuo等[8]的方法测定。自由基清除率=(1-Asample/Acontrol)×100%，其中Asample代表样品的吸光度值，Acontrol代表空白对照的吸光度值。

1.2.4 草鱼的保鲜效果评估实验

1.2.4.1 保鲜实验

将于市场购买的(12.5±0.25) kg鲜活草鱼运至实验室，去除内脏后取肌肉切成约1 cm厚的鱼块，放入不同的保鲜液中浸泡20 min，取出沥干，然后放入聚乙烯托盘中并用保鲜膜包裹，最后置于(4±1) ℃贮藏。在贮藏的0、3、6、9和12 d分别取对照组以及不同处理组，测定相关指标。实验3次重复，其中以蒸馏水作为空白对照组，4个处理组制备方法如下。

1)壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒的制备：25 mg/mL的乙醇卵磷脂溶液，1%的壳聚糖溶液，两者质量比为10∶1，迷迭香提取物终浓度为0.9 mg/mL。

2)壳聚糖纳米粒的制备：25 mg/mL的乙醇卵磷脂溶液，1%的壳聚糖溶液，按照两者质量比为10∶1进行交联。

3)壳聚糖溶液：将配好的1%的壳聚糖溶液用蒸馏水稀释到所需体积。

4)迷迭香提取物溶液：迷迭香提取物终浓度为0.9 mg/mL。

1.2.4.2 保鲜效果评估

肌原纤维蛋白的提取按照Sun等[9]的方法进行。取25 g鱼肉，加入10倍体积的Tris-HCl缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L KCl, pH 7.0)，均质2 min，低温冷冻离心15 min，倒掉上清液，将沉淀物与一定体积的Tris-HCl缓冲液(0.6 mol/L KCl, 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.0)进行匀浆处理，保持低温条件下再提取60 min，同样低温冷冻离心15 min，保留上清液，浓度用双缩脲法测定。

肌原纤维蛋白盐溶性的测定，通常以测得的蛋白含量占初始蛋白含量的百分比作为肌原纤维蛋白的盐溶性。

肌原纤维蛋白巯基含量的测定，参考Suvanich等[10]的方法测定。总巯基含量用摩尔消光系数计算，以nmol/mg蛋白表示。巯基含量(nmol/mg)=A×V/ε×C。其中，A为吸光度，V为稀释倍数，ε为吸光系数，数值为13 600 M/cm,C为蛋白质浓度。

肌原纤维蛋白表面疏水性的测定，参考Kaale等[11]的方法测定。蛋白质的疏水性表示为相对荧光强度与蛋白质的比值。血红素铁含量的测定，根据Maqsood等[12]的方法测定。

1.3 数据分析

用SPSS 22.0对实验数据进行统计分析，显著性差异采用ANOVA进行分析，结果用平均值±标准偏差(Mean±SD)表示，P<0.05为差异显著。

2 结果与讨论

2.1 迷迭香提取物浓度对壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒物理性质的影响

迷迭香提取物浓度对壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒粒径及电位的影响如图1所示。与壳聚糖纳米粒相比，壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒平均粒径增大，并且随着迷迭香提取物浓度的增加，粒径也呈现出增加的趋势，但当提取物质量浓度增加到0.6 mg/mL时，粒径开始出现明显减小现象，这可能是由于随着迷迭香提取物浓度的增加，分子间的作用力加强，导致粒径减小。壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒的表面电位在+30.63～+36.03 mV之间，表明形成的纳米粒比较稳定[13]。综合考虑纳米粒粒径与电位大小，选取0.9 mg/mL为迷迭香提取物为最佳浓度，制备壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒。在该条件下，制得的壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒粒径为(211.9±8.2) nm,表面电位(35.6±1.8) mV。

图1 不同迷迭香提取物添加量对纳米粒粒径、电位的影响Fig.1The effects of different rosemary extract concentrationon nanoparticles mean size and zeta potential

2.2 迷迭香提取物的标准曲线

图2表示迷迭香提取物的标准曲线，回归方程为：y=6.170 9x+0.020 7,R2=0.997 0。x代表迷迭香提取物质量浓度(单位为mg/mL),y代表迷迭香溶液吸光值。从结果中可以看出，在0～0.2 mg/mL的含量范围内迷迭香提取物浓度与吸光度值呈现较好的线性关系，标准曲线可以用于后续实验的测定。

图2 迷迭香提取物标准曲线Fig.2Standard curve of rosemary extract

2.3 壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒体外缓释效能

缓释效能是衡量纳米粒的一个重要指标，被包埋的活性物质从纳米粒中缓慢释放出来，延长活性物质的作用时间，提高其作用效果。图3显示了在不同pH下壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒(含量0.9 mg/mL RE)的缓释结果。从结果中可以看出，在0～15 h，纳米粒出现明显的快速释放现象，这是由于有一部分迷迭香提取物附着在壳聚糖纳米粒的表面，而没有被包埋进去，两者之间存在较弱的分子间作用力，使得这部分迷迭香提取物比较容易集中从体系中释放出来。在15～30 h，纳米粒呈现缓释现象，并且在不同的pH条件下表现出不同的缓释速度。缓释阶段持续时间比较长，这可能是由于被包埋在壳聚糖纳米粒内部的迷迭香提取物，两者之间存在较强的分子间作用力，物质结合紧密，难以解脱出来。研究结果同时显示，在pH值 6.0和6.8两种条件下，壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒均表现出较好的缓释效能，表明壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒表面缓释性具有较好的pH稳定性，为提高迷迭香提取物的生物利用度奠定了基础。

2.4 壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒抗氧化能力的测定

DPPH、ABTS自由基清除率是衡量抗氧化物质抗氧化能力的常用指标，自由基清除率的高低受物质抗氧化性强弱的影响。壳聚糖、壳聚糖纳米粒、迷迭香提取物、壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒的抗氧化能力结果如图4所示。由图4可知，壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒具有较强的DPPH自由基清除能力，清除率可达92.47%，其活性显著高于壳聚糖、壳聚糖纳米粒与迷迭香提取物溶液(P<0.05)。

不同于DPPH，ABTS作为一种电子受体，其在734 nm处的吸光强度会受到抗氧化剂的抑制。从图4(B)中可知，壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒具有ABTS自由基清除能力，清除率可达93.98%，其清除自由基活性显著高于壳聚糖、壳聚糖纳米粒与迷迭香提取物(P<0.05)，其结果与DPPH自由基清除率效果一致。表明迷迭香提取物经过纳米包埋后改善了其抗氧化能力。

图3 壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒(含0.9 mg·mL-1 RE)在不同pH下的缓释性能Fig.3The slow release property of chitosan/rosemary extractnanoparticles (0.9 mg·mL-1 RE) under different pH

图4 4种保鲜剂的DPPH(A)和ABTS(B)自由基清除能力CS：壳聚糖(1%)；CS-NPs：壳聚糖纳米粒(1%)；RE：迷迭香提取物(0.9 mg·mL-1 RE)；CS /RE-NPs：壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒(含0.9 mg·mL-1 RE)。不同保鲜剂标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Fig.4DPPH(A) and ABTS(B) radicalscavenging activity of four preservatives1% CS and CS-NPs, 0.9 mg·mL-1 RE and CS/RE-NPs.Different preservatives marked with different lowercases indicatessignificant difference (P<0.05).

2.5 壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒对冷藏草鱼蛋白氧化的影响

不同保鲜液处理对草鱼冷藏期间蛋白盐溶性的影响如图5所示。随着贮藏时间的增加，各处理组的蛋白盐溶性逐渐降低，并且前期的下降速度比较快，后期较为平缓。相较于空白对照组与其他处理组，壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒组能够显著延缓蛋白盐溶性的降低(P<0.05)。在第12天，空白组、壳聚糖、壳聚糖纳米粒、迷迭香提取物、壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒处理组的草鱼蛋白盐溶性与初始值相比分别下降了43.19%、41.30%、43.57%、40.16%、33.15%。可能是因为相比于冷冻条件，冷藏条件下的微生物较活跃且内源酶活较高，加速了蛋白质的氧化变性。而壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒可以有效地抑制微生物的生长繁殖和内源酶活性，充分发挥其抗氧化作用，从而抑制蛋白的氧化变性。因此，壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒处理组的草鱼蛋白盐溶性降幅最小。

图5 不同处理对草鱼蛋白盐溶性的影响Fig.5The effects of different treatments onSEP of grass carp

巯基作为水产品蛋白质中最具有活性的功能基团，在维持肌原纤维蛋白空间结构的稳定性方面具有重要意义。总巯基由活性巯基和隐藏巯基两部分组成[14]，巯基的氧化在一定程度上反应了蛋白的氧化程度[15]。不同处理对冷藏草鱼总巯基含量影响如图6所示，从图中可看出，总巯基含量随着贮藏时间的延长呈现波动下降趋势，其中空白对照组与壳聚糖处理组下降幅度最大，截至货架期结束(12 d)，分别从最初的12.2×10-5mol/g下降至8.5×10-5和7.6×10-5mol/g。而迷迭香提取物与壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒处理组巯基含量的下降速度较为缓慢(P<0.05)，分别从最初的12.2×10-5mol/g下降至10.2×10-5mol/g和10.8×10-5mol/g，而且这两组样品的巯基含量在贮藏后期下降趋于平缓。这与黄晓春等[16]研究的美国红鱼(SciaemopsOcellatus)结果类似。巯基含量下降的原因可能与冷藏过程中巯基氧化形成了蛋白聚集体有关[15]。壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒可抑制巯基氧化，减少其含量下降，从而保持草鱼良好品质。

图6 不同处理对草鱼总巯基含量的影响Fig.6The effects of different treatments onsulfydryl content of grass carp

蛋白表面疏水性的变化情况能够反映蛋白质的变性程度，表面疏水性越大，蛋白变性程度越大[17]。不同处理方式对冷藏草鱼表面疏水性的影响如图7所示。结果显示，随着贮藏时间的增加，草鱼样品的表面疏水性均呈现先增强后减弱的趋势，在贮藏12 d后，对照组和4个处理组的表面疏水性均显著高于贮藏0 d时(P<0.05)。在贮藏初期，蛋白质变性伸展，使埋藏在内部的疏水性氨基酸向外暴露，因此蛋白表面疏水性呈现逐渐上升趋势；到了贮藏后期，疏水性相互作用增强，形成蛋白质聚集体，一部分疏水基团又被包埋在蛋白聚集体内部，导致表面疏水性降低[18]。结果表明，贮藏12 d，对照组、壳聚糖、壳聚糖纳米粒、迷迭香提取物和壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒处理组的样品表面疏水性分别比冷藏初期增加了73.08%、65.31%、59.75%、33.66%、30.77%，且壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒处理组的增加量显著低于其他处理组(P<0.05)。表明壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒有助于延缓草鱼贮藏过程中肌原纤维蛋白表面疏水性的增加，延缓蛋白结构的变化。

图7 不同处理对草鱼表面疏水性的影响Fig.7The effects of different treatmentson surface hydrophobicity of grass carp

血红蛋白是肌肉中脂肪氧化的有效催化剂，随着贮藏时间的延长，会导致血红蛋白发生氧化造成其含量降低，同时，血红素铁会从卟啉环中游离出来作为一种助氧剂，诱导脂肪发生氧化[19]。因此，草鱼在贮藏过程中血红素铁含量的变化，可以在一定程度上反映蛋白的氧化程度。

不同处理对冷藏草鱼血红蛋白含量的影响如图8所示。随着贮藏时间的延长，各处理组的血红素铁含量均呈现下降趋势，这是由于血红蛋白氧化、血红素的降解所致[20]。其中，空白对照组与壳聚糖处理组下降速率最快(P<0.05)，分别由初始的7.58×10-2mg/g降至1.98×10-2和1.56×10-2mg/g。在整个贮藏期间，壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒处理组的血红素铁含量始终保持在较高水平，与其他处理组差异显著(P<0.05)，表明壳聚糖/迷迭香提取物纳米粒能够抑制血红蛋白的氧化，从而阻止血红素铁的释放游离。