miR—101调控非小细胞肺癌的发病机制

王海江　宋丽霞　汪文斐　杨争　夏照华　黄丕来　李国保　陈培芬　关彩艳

[摘要] 目的 探讨miR-101在非小细胞肺癌发生、发展中的作用以及新的分子调控机制。 方法 将miR-101转染到非小细胞肺癌A549细胞株，比较测量人类非小细胞肺癌组织及癌旁组织的miR-101表达水平。采用生物信息学技术预测miR-101在c-Fos的3′UTR潜在结合靶点，然后采用Western blot法和基因敲除方法检测c-Fos的表达和功能。 结果 分析miR-101在非小细胞肺癌组织及癌旁组织表达，miR-101在非小细胞肺癌组织中低表达（0.00010±0.00002 vs 0.00021±0.00003，P=0.036），过表达miR-101抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖并诱导细胞凋亡。并且在非小细胞肺癌细胞中敲除c-Fos和过表达miR-101有相似的效果。 结论 miR-101通过c-Fos靶点调节非小细胞肺癌细胞的生长，因此调控miR-101和c-Fos可以应用于非小细胞肺癌潜在的分子治疗。

[关键词] 微小RNA-101；c-Fos；非小细胞肺癌；发病机制

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）24-0008-04

The pathogenesis of miR-101 in the regulation of non-small cell lung cancer7

WANG Haijiang SONG Lixia WANG Wenfei YANG Zheng XIA Zhaohua HUANG Pilai LI Guobao

CHEN Peifen GUAN Caiyan

Department of Thoracic Surgery， Shenzhen Third People's Hospital， Shenzhen 518112， China

[Abstract] Objective To investigate the role of miR-101 in the development and progression of non-small cell lung cancer and its new molecular regulation mechanism. Methods miR-101 was transfected into non-small cell lung cancer A549 cell line， and the expression level of miR-101 in human non-small cell lung cancer tissues and adjacent tissues was compared. The bioinformatics technique was used to predict the potential binding of miR-101 to the 3'UTR of c-Fos， and then the expression and function of c-Fos were detected by Western blot and gene knockout. Results The expression of miR-101 in non-small cell lung cancer tissues and adjacent tissues was analyzed. miR-101 was down-regulated in non-small cell lung cancer tissues （0.00010±0.00002 vs 0.00021±0.00003， P=0.036）. And overexpression of miR-101 was inhibited. Overexpression of miR-101 inhibited proliferation and induced apoptosis in non-small cell lung cancer A549 cells. And knocking out c-Fos and overexpressing miR-101 in non-small cell lung cancer cells had similar effects. Conclusion miR-101 regulates the growth of non-small cell lung cancer cells through c-Fos target， so the regulation of miR-101 and c-Fos can be applied to the potential molecular therapy of non-small cell lung cancer.

[Key words] MicroRNA-101； c-Fos； Non-small cell lung cancer； Pathogenesis

近年來肺癌的发病率及死亡率在全球均位居首位，如果从过去三十年算起，至今中国肺癌的发病率增长了465%。估计2017年中国肺癌发病率可上升至80万例，而死亡人数达70万例，肺癌已成为人类癌症死亡的主要原因之一。此外，随着人口老龄化和环境污染加剧，肺癌发病率具有逐年上升的趋势。大部分肺癌是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），占肺癌总发病率的80%左右[1]。不幸的是，大部分的NSCLC患者在诊断时已经是肺癌晚期或远处转移[2]，因此，NSCLC的治疗效果一直很差，预后也不理想。可见，肺癌日益成为国内外医学界面临的一个严峻挑战，对肺癌（特别是NSCLC）发病机制和防治手段的探索非常迫切，因此，进一步研究调控NSCLC发生发展的机制具有重要意义。本研究对11例NSCLC组织及11例癌旁组织进行微小RNA-101（miR-101）表达分析，探讨miR-101在NSCLC临床组织中的表达和功能。

1 材料与方法

1.1组织样本和细胞系

选取我院自2016年11月～2017年10月胸外科手术切除的11例经病理确诊为NSCLC组织标本和与之匹配的癌旁组织，所有患者均知情同意并签署知情同意书。本研究通过我院伦理委员会审查并批准，所有实验均按照相关的指南和规定完成。

NSCLC细胞株A549来源于ATCC（Manassas，VA，USA），从中国科学院生物化学与细胞生物学研究所获得。用补充10%胎牛血清、2 μM谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL硫酸链霉素的DMEM培养液培养细胞。

1.2 RNA提取和实时定量PCR（RT-PCR）

使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）按照产品说明书提取总RNA，并于-80 °C下保存备用。检测miRNA表达时，使用ABI miRNA反转录试剂盒（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）将约10 ng RNA反转录为cDNA，并使用U6基因作为内参对照。检测c-Fos表达时，根据产品说明书使用ABI反转录试剂盒（Applied Biosystems，USA），将每个样品的1 μg总RNA反转录为cDNA。使用ABI SYBR Green Master试剂盒（Applied Biosystems， USA），按照说明书，对每个样品进行qRT-PCR分析，每个样本一式三份，重复操作3次。以GAPDH作为内参，所用引物序列为：上游：（1）C-Fos：5′-CGTGCCAGACATGGACCTAT-3′（正向）和5′-CGGGGTAGGTGAAGACGAAG-3′（反向）；下游：（2）GAPDH： 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′（正向）和5′-GCATGGACTGTGGTCATGAG-3′（反向）。

根据下列方法计算表达比：

MiR-101表达=2-CT值（miR-101）-CT值（U6）；

c-Fos表达=2-CT值（C-Fos）-CT值（GAPDH）。

1.3 miRNA mimics、c-Fos siRNA 和转染

设计人miR-101双链模拟物（miR-101）和阴性对照寡核苷酸双链模拟物（miR-NC），并由广州锐博生物科技有限公司（中国广州）合成，c-Fos siRNA和对照siRNA寡核苷酸均购自Santa Cruz 公司（Santa Cruz，USA）。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）按照产品说明书进行miRNA或siRNA转染。

1.4 miRNA靶点预测

利用网站程序www.microRNA.org检索可能的miRNA靶基因。

1.5 荧光素酶检测

使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen，USA），按照产品说明书，将c-Fos 3UTR质粒、海肾荧光素酶（Renilla luciferase）pPRL-TK載体（Promega，Madison，WI，USA）和miR-101 mimics/miR-NC mimics转染到A549细胞中，48 h后测定双荧光素酶报告基因测试系统（Promega，USA）的发光强度。

1.6 细胞存活率分析

使用细胞计数KIT-8（CCK-8）分析试剂盒（Dojindo，Japan），根据产品说明书测定细胞存活率。

1.7 Caspase 3/7 活性

按照产品说明书（Pierce，USA）进行Caspase 3/7活性分析。将 A549细胞接种至96孔培养板中进行培养，在测试之前，用PBS洗涤细胞，然后将细胞与Caspase Glo 3/7试剂室温下孵育1～2 h。使用微孔板光谱分析仪（Tecan Infinite M200，Switzerland）测定每个样品的发光强度。

1.8 免疫印迹（Western blot）分析

提取总蛋白时，用1×PBS洗涤细胞，然后用RIPA缓冲液于冰上裂解细胞15 min，12000转/min离心15 min，收集上清。按照实验步骤，用不同抗体对提取的蛋白质进行免疫印迹测试，使用的一抗为抗c-Fos（稀释：1：2000）和抗GAPDH（1：10000抗体（Cell Signaling Technology，USA）。

1.9 统计学方法

采用SPSS 20.0进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验；计数资料采用百分比表示，采用χ2检验。相关性分析采用Spearman相关系数。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA表达分析

本研究对11例非小细胞肺癌组织及11例癌旁组织进行miRNA表达分析，发现miR-101在非小细胞肺癌组织中呈低表达状态（0.00010±0.00002 vs 0.00021±0.00003，P=0.036）。

2.2 miR-101可调控非小细胞肺癌细胞生长

本研究进一步对miR-101生物学功能进行探讨。采用miR-101mimics增高非小细胞肺癌A549细胞内miR-101的水平，结果发现：miR-101过表达后，A549细胞的增殖下降[（50±5）% vs（95±4）%，P=0.001]（表1）。此外，检测细胞内Caspase 3/7水平，结果发现A549细胞内Caspase 3/7水平增高（4000±500 vs 2800±510，P=0.010）（表1），提示A549细胞发生了凋亡。上述的结果表明：miR-101可调控非小细胞肺癌的生长。

2.3 miR-101调控c-Fos的表达

为了进一步探讨miR-101的作用机制，本研究对其靶基因进行了分析，发现c-Fos与miR-101存在结合靶点（图1A）；荧光色素酶实验显示：miR-101 mimics可下调含结合位点的荧光质粒的表达（图1B）；此外，A549细胞转染了miR-101 mimics后，c-Fos表达下调[（60±5）% vs（98±3）%，P=0.001]（图1C）。这些结果提示：c-Fos是miR-101的靶基因。

2.4 c-Fos调控非小细胞肺癌细胞生长

为进一步探讨c-Fos对非小细胞肺癌的影响，本研究采用c-Fos siRNA转染非小细胞肺癌A549细胞，发现A549细胞增殖下降[（60±4）% vs （98±3）%，P=0.001]，Caspase 3/7表达增加[（3600±200） vs （2400±300），P=0.001]（表2），其结果与转染miR-101一致。这提示：c-Fos可调控非小细胞肺癌细胞生长，而c-fos可能是miR-101的功能基因。

2.5 c-Fos在非小细胞肺癌组织中高表达

为进一步探讨c-Fos在非小细胞肺癌的表达，本研究对11例非小细胞肺癌组织及11例癌旁组织进行mRNA表达分析，发现c-Fos呈高表达状态（0.0050±0.0010 vs 0.0015±0.0005，P=0.0086），这与miR-101表达相反。进一步验证了上述c-Fos可能是miR-101功能基因的研究假设。

3 讨论

miRNAs是一类非编码单链微小分子RNA，是机体非常重要的调控分子[3]。miRNAs全长为18～25 bp，由基因组转录出具有茎环结构的转录前体，再经加工而成。miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对形成引导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻译，从而表现在转录及转录后水平对靶基因的表达进行调控。基因组中，1/3以上的基因受miRNAs调控，一个miRNA可结合多个靶基因，而一个mRNA也可由多個miRNA共同调节，从而形成复杂的网络调控系统。

许多研究证实miRNAs是多种肿瘤发生过程中关键的调控分子[4-7]，在NSCLC中也发生miRNA表达改变。本研究证实了在NSCLC中miR-101和c-Fos的功能和相互作用。miR-101在NSCLC组织中的表达下调，这与以前的研究结果也是一致的[8]。过表达miR-101抑制非小细胞肺癌A549细胞生长，表明miR-101是NSCLC的肿瘤抑制因子[9，10]。这些均支持过度表达miR-101是NSCLC的一种潜在的基因治疗，可能会使NSCLC患者治疗获益。

已有研究表明，肺癌组织细胞中，let-7、miR-15、miR-30、miR-126及miR-142等miRNA表达下调；而miR-21、miR-27、miR-93、miR-128、miR-155、miR-181、miR-214以及miR-301等在肺癌细胞中高表达[5，11-13]。而这些miRNA亦调控肺癌细胞增殖等生物学行为。miRNA的调节功能是通过直接作用靶基因与3'UTRs的相互结合而发挥作用。在这项研究中，萤光素酶实验显示：过表达miR-101可下调含结合位点的c-Fos荧光质粒的表达，此外，A549细胞转染了miR-101后，c-Fos表达下调。这些结果证实c-Fos是miR-101的靶基因。

c-Fos是一种重要的核内癌基因，经mRNA转录后的c-Fos蛋白，由380个氨基酸组成，其中含有4个外显子和3个内含子。具有亮氨酸拉链结构，内含二聚化结合区可与DNA中的5-TGAG/CTCA-3序列结合而转录激活。因此，它调节基因表达并参与多种生物过程。考虑到在肿瘤发生和转移相关基因的激活中c-Fos的重要性，研究了c-Fos在miR-101介导的抗肿瘤中的作用。敲除c-Fos和miR-101过表达有类似的效果。 因此，这些结果表明miR-101在NSCLC A549细胞上的生物学功能至少部分是通过c-Fos靶基因完成。miR-101和c-Fos相互作用在其他肿瘤如骨肉瘤、膀胱癌、肝细胞癌和子宫内膜癌中也已有报道[5，9，14]。随后，c-Fos被确定为miR-101在这些肿瘤中的直接靶基因，并且在转录后受miR-101负调控，这与目前研究一致。

随着EGFR突变/ALK融合/ROS1融合等肺癌系列致癌驱动基因的相继确定，我国及国际上多项研究表明靶向治疗药物大大改善和延长携带相应驱动基因的NSCLC患者的预后和生存[15-19]。本研究认为miR-101通过直接抑制c-Fos的蛋白质表达水平，在一定程度上成为NSCLC抑制剂，因此，调控miR-101和c-Fos可以应用于NSCLC潜在的分子治疗。

[参考文献]

[1] Bartel DP. MicroRNAs：Genomics，biogenesis，mechanism，and function[J]. Cell，2004，116（1）：281-297.

[2] Kalathiya U，Padariya M，Baginski M，et al. SimisnoRNA：collection of siRNA，miRNA，and snoRNA database for RNA interference[J]. Turk J Biochem，2015，40（6）：524-532.

[3] Hayes J，Peruzzi P，P Lawler S. MicroRNAs in cancer：Biomarkers， functions and therapy[J]. Trends in Molecular Medicine，2014，20（8）：460-469.

[4] Li XJ，Ren ZJ，Tang JH. MicroRNA-34a：a potential therapeutic target in human cancer[J]. Cell Death & Disease，2014，5（7）：1327.

[5] Zhong K，Chen K，Han L，et al. MicroRNA-30b/c inhibits non-small cell lung cancer cell proliferation by targeting Rab18[J]. BMC Cancer，2014，14（1）：703.

[6] Stahlhut C，Slack FJ. Combinatorial Action of microRNAs let-7 and miR-34 Effectively Synergizes with Erlotinib to Suppress Non-small Cell Lung Cancer Cell Proliferation[J]. Cell cycle，2015，14（13）：2171-2180.

[7] Brighenti M. MicroRNA and MET in lung cancer[J]. Ann Transl Med，2015，3（5）：68.

[8] Yan F，Shen N，Pang J，et al. Restoration of miR-101 suppresses lung tumorigenesis through inhibition of DNMT3a-dependent DNA methylation[J]. Cell Death，2014， 5（9）：1413-1417

[9] Wang Z，He R，Xia H，et al. MicroRNA-101 has a suppressive role in osteosarcoma cells through the targeting of c-Fos[J]. Experimental & Therapeutic Medicine，2016， 11（4）：1293-1299.

[10] Wang L，Zhang LF，Wu J，et al.IL-1beta-mediated repression of microRNA-101 is crucial for inflammation-promoted lung tumorigenesis[J]. Cancer Res，2014，74（17）：4720-4730.

[11] Brighenti M. MicroRNA and MET in lung cancer[J]. Ann Transl Med，2015，3（5）：68.

[12] Stahlhut C，Slack FJ. Combinatorial Action of MicroRNAs let-7 and miR-34 Effectively Synergizes with Erlotinib to Suppress Non-small Cell Lung Cancer Cell Proliferation[J]. Cell Cycle，2015，14（13）：2171-2180.

[13] Crawford M，Brawner E，Batte K，et al. MicroRNA-126 inhibits invasion in non-small cell lung carcinoma cell lines[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，373（4）：607-612.

[14] Li S，Fu H，Wang Y，et al. MicroRNA-101 regulates expression of the v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog（FOS） oncogene in human hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology，2009，49（4）：1194-1202.

[15] Mok TS，Wu YL，Thongprasert S，et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonaryadenocarcinoma[J]. N Engl J Med，2009，361（10）：947-957.

[16] Zhou C，Wu YL，Chen G，et al. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer（OPTIMAL，CTONG-0802）：A multicentre，open-label，randomised，phase 3 study[J]. Lancet Oncol，2011，12（8）：735-742.

[17] Wu YL，Zhou C，Liam CK，et al. First-line erlotinib versus gemcitabine/cisplatin in patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer：analyses from the phase Ⅲ，randomized，open-label，ENSURE study[J]. Ann Oncol，2015，26（9）：1883-1889.

[18] Wu YL，Zhou C，Hu CP，et al. Afatinib versus cisplatin plus gemcitabine for first-line treatment of Asian patients with advanced non-small-cell lung cancer harbouring EGFR mutations（LUX-Lung 6）：an open-label，randomised phase 3 trial[J]. Lancet Oncol，2014，15（2）：213-222.

[19] Solomon BJ，Mok T，Kim DW，et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer[J]. N Engl J Med，2014， 371（23）：2167-2177.

（收稿日期：2018-05-28）