抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽的分离、纯化及特性研究

廖金英,肖光景,郭振亚,黄科荣

(福建农林大学植物保护学院，福建福州350002)

小菜蛾对Bt(Bacillus thuringiensis)的抗性已成为全球关注的问题。昆虫可通过多种方式对Bt δ-内毒素(Cry)蛋白产生抗性。昆虫被诱导产生抗菌肽是其自身建立的免疫防线(Iwanaga et al.,2005),防御物质抗菌肽的生成至少需要1-3 h(Lavine et al.,2002),12-48 h后达到最高水平(Haine et al.,2008)。在个别昆虫中,这种诱导响应可以持续几周,如大黄蜂(Korner et al.,2004)和粉虱(Haine et al.,2008)至少14 d,蜻蜓可持续到44 d(Bulet et al.,1992)。前人研究发现昆虫在受到细菌微生物或者其他外界条件刺激后,体内产生具有抗菌活性的抗菌肽(Steiner et al.,1981),阮华波等(2012)通过菌液注射、菌液饲喂、紫外线照射和超声波诱导的方法,使黄粉虫幼虫产生有较大抑菌活性差异的抗菌肽。昆虫在未经诱导时,自身体内也含有一定数量的抑菌活性较低的抗菌肽,当受到外源病菌等的刺激时,昆虫启动体内机体防御系统,免疫反应生成抗菌肽以抵御侵害(Bulet et al.,2005)。已有研究结果表明,Bt侵染小菜蛾,可影响小菜蛾体内抗菌肽的产生(郑志华等,2016),并且小菜蛾抗菌肽对机体免疫系统发挥重要的协调作用(Li et al.,2012),可知抗菌肽与小菜蛾对Bt产生抗性有不容忽视的关系,但其具体机制还不明确。

目前主要采用离心、超滤、透析、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、固相萃取法、反向高效液相色谱法等方法分离纯化抗菌肽,张建新等(2016)采用大孔吸附树脂法对黄粉虫幼虫抗菌肽进行分离纯化,李哲等(2012)采用Sephacryl-100聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶法对贻贝抗菌肽进行分离纯化,均获得较纯的抗菌肽。

本试验比较小菜蛾抗Cry2Ad毒素品系和敏感品系抗菌肽含量和抑菌活性的差异,初步探讨抗菌肽与小菜蛾对Bt抗性的关系,并对抗Cry2Ad毒素小菜蛾进行分离、纯化,研究其活性,以期通过抗菌肽的研究探索治理抗Bt小菜蛾的途径和策略。而高效、广谱抗菌活性小菜蛾抗菌肽的发现和利用也将对抑菌化合物的开发有重要意义。

1 材料

1.1 供试虫源

敏感品系：小菜蛾敏感品系(Fuzhou-S)由福建农林大学应用生态研究所提供,该品系原始种群采集自福州(26.08°N,119.28°E)田间包菜(Brassica oleracea var.capitata)上(You et al.,2013),在实验室内用盆种萝卜苗饲养,饲养条件温度(25±1)℃,湿度(75±2)%,并且L∶D＝16 h∶8 h,饲养繁殖期间从未接触过任何药剂。

抗性品系：由本实验室内通过给Fuzhou-S品系喂食Cry2Ad毒素蛋白而选择获得具有抗Cry2Ad毒素的小菜蛾抗性品系(Fuzhou-R2Ad),相对于敏感品系Fuzhou-S抗性倍数大约120倍。饲养条件同敏感品系,现已抗性汰选70代以上。长期饲喂筛选出抗Cry2Ad毒素的小菜蛾Fuzhou-R2Ad品系。

1.2 Bt菌株和毒素

Bt(B.thuringiensis)菌株BRC-HZP10由福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室提供。

用于小菜蛾抗性筛选和生物测定的Cry2Ad毒素来源于Bt菌株BRC-HZP10,经过提取、分离和纯化,使用时用含有0.1%Triton X-100的纯水稀释。

1.3 供试菌株

大肠埃希氏菌Escherichia coli,革兰阴性杆菌,南京茂捷微生物科技有限公司提供。

金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus,革兰阳性球菌,南京茂捷微生物科技有限公司提供。

2 试验方法

2.1 小菜蛾抗菌肽提取

将健康Fuzhou-R2Ad品系和Fuzhou-A品系小菜蛾3龄幼虫挑选入一次性塑料杯[杯口×杯底×杯高：78 mm×51 mm×82 mm]中,饥饿处理2 h。在生长良好的盆栽萝卜苗上均匀喷施Cry2Ad毒素(浓度为100 μg·mL-1),并放置晾干。将饥饿处理后的小菜蛾转接入盆栽萝卜苗上,置培养箱中温度(25±1)℃,湿度(75±2)%,光周期L∶D＝16 h∶8 h饲养,72 h后,收集存活小菜蛾幼虫称取体重,然后置于1.5 mL离心管中,每个离心管放置10头小菜蛾幼虫,冷冻保存,以备提取抗菌肽。

在装有小菜蛾幼虫的离心管中,加入0.2 mL以无菌水配制的0.1 g·mL-1抗坏血酸溶液和0.2 mL pH为5.0的乙酸铵缓冲液,用研磨棒充分碾磨成匀浆。将匀浆液放入100℃水浴5 min,取出后立即于离心机中1 000 r·min-1、4℃离心30 min。用移液器吸取上清液,此上清液即为抗菌肽的粗提物,用截留量为20 KDa的超滤离心管过滤,收集下层过滤液于1.5 mL离心管中,置冰箱4℃短期保持(王立新等,2008)。

2.2 抗菌肽含量测定

根据Bradford(1976)的考马斯亮蓝法,配制考马斯亮蓝G-250试液。取牛血清蛋白和纯化水配比成浓度分别为 0、200、400、600、800、1 000 μg·mL-1标准蛋白溶液,显色 2 min 后,以纯水作为对照,在595 nm处测吸光值。以牛血清蛋白含量(μg)为横坐标,OD595值为纵坐标作标准曲线,用DPS统计标准曲线相关系数、95%置信限。标准曲线的公式为：y＝0.0006x+0.2115,R2＝0.9903。可用紫外分光光度法测定抗菌肽OD595值,用该标准曲线计算抗菌肽含量。

将提取到的抗菌肽粗提液用截留分子量为3 KDa的超滤离心管浓缩,每1 g提取的抗菌肽统一收集并定容至5 mL容量瓶中。吸取0.1 mL抗菌肽粗提液于试管中,加入1 mL无菌水稀释,并加入5 mL配制好的显色剂考马斯亮蓝G-250试剂,摇匀,放置2 min后测定OD595值,以无菌水作为对照,每个处理重复三次,以测得的OD595带入标准曲线方程中计算抗菌肽含量。

2.3 抗菌肽抑菌活性测定

分别吸取3 mL培养活化好的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌悬浮液于装有150 mL的温热的LB固体培养基中,摇匀,倒平板。每种菌液各倒9个平板,每个平板放置3片纸碟(直径6 mm),其中3个平板纸碟上分别滴加8 μL被喂食Cry2Ad毒素抗Cry2Ad小菜蛾的抗菌肽溶液、抗Cry2Ad毒素品系小菜蛾的抗菌肽溶液和无菌水；3个平板纸碟上分别滴加8 μL被喂食Cry2Ad毒素抗Cry2Ad小菜蛾的抗菌肽溶液、被喂食Cry2Ad毒素的敏感品系小菜蛾的抗菌肽溶液和无菌水；3个平板中分别滴加被喂食Cry2Ad毒素抗Cry2Ad小菜蛾和敏感品系小菜蛾的抗菌肽溶液及无菌水,其中无菌水为阴性对照。每个平板倒扣在生化培养箱中30℃培养24 h,记录抑菌圈直径,用公式(1)统计抑菌效果。

2.4 小菜蛾抗菌肽分子量测定

2.4.1 超滤管离心分离粗提液 取分子截留量为10 KDa的15 mL超滤管,内管加无菌水,冰上预冷5 min,外管及盖子用无菌水冲洗3次后晾干备用；吸取抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽粗提液至超滤管内管中,4℃下5 000 r·min-1离心30 min,吸取超滤管下层液体至灭菌处理过的0.5 mL EP离心管中,备用。

2.4.2 SDS-PAGE电泳检测抗菌肽分子量 用SDS-PAGE电泳检测小菜蛾抗菌肽粗提液超滤管离心分离结果(Bradley et al.,1995)。聚丙烯酰胺凝胶配置及电泳方法参见分子克隆实验指南(萨姆布鲁克,1991),稍作改动(王立新等,2008)。蛋白质Marker干粉用1×蛋白缓冲液150 μL充分溶解,沸水浴5 min,冷却后分装,每管10 μL,-20℃保存备用。取抗Cry2Ad毒素抗性品系和敏感品系小菜蛾抗菌肽经超滤管纯化的下层溶液各20 μL,分别加入5×蛋白上样缓冲液5 μL,移液枪反复吸打使其充分混匀,10 μL上样。取分装小管的蛋白质Marker,室温融化后,沸水浴5 min,20 μL上样。

2.5 抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽分离、纯化

将732型阳离子交换干树脂和717型阴离子交换干树脂用饱和NaCl溶液浸泡1-2 h,用纯水清洗至流出液变白后纯水浸泡12-24 h。用5%NaOH溶液浸泡60-120 min,然后水洗至pH＝7.0,再用5%HCl溶液和5%NaOH溶液分别浸泡阳离子交换树脂和阴离子交换树脂12-24 h,备用(李欣等,2014)。

将处理好的离子交换树脂装入层析柱(15 mm×400 mm)中,用pH 3.0的缓冲液(11.4 mL的0.2 mol·L-1盐酸与50 mL的0.2 mol·L-1甘氨酸混合)平衡阳离子交换树脂(Hunter et al.,2001),用pH 12.0的缓冲液(11.4 mL的0.2 mol·L-1NaOH与50 mL的0.2 mol·L-1甘氨酸混合)平衡阴离子树脂(周虎,2015)。分别加入2 mL经截留分子量为10 KDa超滤管分离后的下层抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽溶液,用pH为12.0的0.2 mol·L-1NaOH溶液洗脱阳离子交换柱,用pH为3.0的5%HCl溶液洗脱阴离子交换柱,形成的pH梯度范围为3.0-12.0。洗脱流速为3 mL·min-1,每管收集3 min,用自动部分收集器收集流出液,直到流出液的pH值为6-7。

以洗脱液作为参比液,检测各管分离液OD280值。收集吸收值大于0.1且较为集中区域的各分离液,用截留分子量为3 KDa的超滤浓缩离心管浓缩,加100 μL无菌水转移出超滤管上层物质,进行抑菌活性测定。

分别吸取3 mL培养活化好的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌悬浮液(菌液浓度为105CFU·mL-1)于装有150 mL的温热的LB固体培养基中,摇匀,倒平板。每个平板放置4片纸碟(直径6 mm),分别吸取各部分收集液8 μL滴加在纸碟上,以滴加灭过菌的洗脱液为阴性对照。每个平板倒扣在生化培养箱中30℃培养24 h,记录抑菌圈直径,按公式(2)计算抑菌率,并统计分析各组分抑菌活性差异。

3 结果与分析

3.1 不同品系小菜蛾抗菌肽含量差异

提取Fuzhou-S品系和抗Cry2Ad毒素的品系(Fuzhou-R2Ad)小菜蛾抗菌肽,利用考马斯亮蓝G-250法测定抗菌肽含量(表1),结果表明：抗Cry2Ad毒素的小菜蛾品系(Fuzhou-R2Ad)体内抗菌肽含量浓度较敏感品系小菜蛾更高,并且喂食Cry2Ad毒素后,小菜蛾体内抗菌肽都显著增加,而抗Cry2Ad毒素的小菜蛾抗菌肽增加尤为明显。

表1 不同处理后小菜蛾死亡率及其抗菌肽浓度1)Table 1 Mortality and antibacterial peptide concentration of P.xylostella induced by different methods

3.2 不同品系小菜蛾抗菌肽抑菌活性差异

通过比较不同诱导处理的Fuzhou-S品系和抗Cry2Ad毒素的品系(Fuzhou-R2Ad)小菜蛾抗菌肽含量和抑菌效果,结果表明,抗Cry2Ad毒素小菜蛾体内抗菌肽对革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌E.coli和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌S.aureus的抑菌效果都极显著高于敏感品系小菜蛾(表2,图1)。

表2 小菜蛾抗菌肽抑菌活性1)Table 2 The antimicrobial activity of antibacterial peptide from P.xylostella

图1 不同品系小菜蛾抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑菌活性Figure 1 The antibacterial activity of antibacterial peptides from different P.xylostella strains against Straphylococcus aureus

小菜蛾被饲喂Cry2Ad毒素72 h后,抗Cry2Ad毒素小菜蛾体内抗菌肽含量显著提高。由此可知,Cry2Ad毒素可诱导小菜蛾产生抗菌肽,小菜蛾对Cry2Ad毒素产生抗性后,其体内的抗菌肽含量和活性都表现出特异性,相较于敏感品系,抗菌肽含量更高,对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性更强,初步认为小菜蛾体内抗菌肽与其对Cry2Ad毒素的抗性相关。

3.3 SDS-PAGE凝胶电泳检测抗菌肽分子量

从SDS-PAGE凝胶电泳检测结果可以看出(图2),抗Cry2Ad毒素品系小菜蛾被检测出含有介于3-20 KDa多肽类主要有3种,而敏感小菜蛾只检测出有2种,抗Cry2Ad毒素品系小菜蛾含有一分子量约为7.8 KDa的肽类物质,根据抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽含量和活性表现的特异性,初步认为该分子量约为7.8 KDa的多肽为抗Cry2Ad毒素小菜蛾所有的特异性抗菌肽。

图2 SDS-PAGE凝胶电泳测定结果Figure 2 Test results of SDS-PAGE Gel electrophoresis

3.4 抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽分离纯化结果

用732型阳离子交换树脂层析抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽,共收集40管洗脱液,检测每管洗脱液的OD280值,OD280值越高,抗菌肽含量越多(Luo et al.,2013；Zlili et al.,2004),结果如图3A所示。取OD280值较高的第5-14管分离液进行进一步抑菌活性测定。从抑菌圈试验结果来看(表3,图4),5-14号管各组分对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌皆有一定抑菌活性,其中第8号管收集液对大肠埃希菌的抑菌活性较高,可知该组分为活性抗菌肽成分。

图3 离子交换层析分离小菜蛾抗菌肽效果Figure 3 Effect of chromatographic separation of antimicrobial peptide from P.xylostella on ion exchange column chromatography

表3 离子交换柱分离组分抑菌活性1)Table 3 Bacteriostatic activity of separated fractions from ion exchange column

图4 SDS-PAGE凝胶电泳测定结果Figure 4 Test results of SDS-PAGE Gel electrophoresis

用717阴离子交换树脂分离的收集液在5-10管中吸收值较大,第6管吸收值最大(图3B),从抑菌圈试验结果可以看出(表3,图4),5-10号管各组分对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌皆有一定抑菌活性,其中6、7号管组分对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌活性较好,可知该几个组分皆为抗菌肽活性成分。

比较阳离子和阴离子交换柱层析对抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽的分离存活效果,发现采用阴离子柱层析分离的各抑菌活性组分较快出柱,且较为集中,拖尾不明显。

4 小结与讨论

本研究中发现,敏感品系小菜蛾喂食Cry2Ad毒素后,被诱导产生了抗菌肽。不同的诱导方法可使昆虫产生不同的抗菌肽,本研究中小菜蛾被喂食Cry2Ad毒素后体内抗菌肽含量显著提高,可知Cry2Ad毒素可诱导小菜蛾产生抗菌肽。

比较抗Cry2Ad毒素小菜蛾品系与敏感小菜蛾品系抗菌肽的含量和抑菌活性发现,抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽的含量和抑菌活性都具有特异性,通过抗菌肽分子量测定发现,其体内多含有一分子量约为7.8KDa的抗菌肽。可以认为小菜蛾体内抗菌肽的种类、含量及活性特征与小菜蛾对Cry2Ad毒素的抗性有一定的关联。Wang等(2012)采用针刺法诱导小菜蛾产生抗菌肽,用SDS-PAGE凝胶电泳法结合质谱测得其抗菌活性多肽分子量为4.4 KDa。党向利等(2011)从家蝇蛹体内分离纯化出三种抗菌肽及一种抗菌化合物,表明昆虫体内含多种抗菌物质共同发挥抗菌作用,其中三种抗菌肽的分子量分别约为12 KDa、8 KDa、4 KDa,本试验分离获得的抗菌肽分子量范围与其较为接近。

本试验中采用超滤法对小菜蛾抗菌肽粗提液进行初步分离,利用抗菌肽带电荷的特性,分别采用阴阳离子交换树脂法进一步分离纯化,可以得到较好的分离、纯化效果,该方法较为简便,且损失量少。本研究结果可为今后从分子水平探讨抗菌肽与小菜蛾对Cry2Ad毒素抗性的机理奠定理论基础。抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽的纯化获得可为进一步研究抗菌肽蛋白结构和基因研究提供材料,也可为从免疫系统调控对小菜蛾进行治理提供理论基础。