一株高效解磷真菌的筛选及其解磷机理研究

王伟伟

摘要 为提高土壤中磷肥利用率，从耐贫瘠作物火龙果根际分离到一株具有高效解磷功能的真菌，命名为An-6，并对其解磷机理进行研究。在以Ca₃（PO）为唯一磷源的无机磷液体培养基中接种该菌株，培养96h后，可溶性磷含量达到764.4mg/L，且可溶性磷含量与发酵液PH呈极显著负相关。通过高效液相色谱分析，发酵液中含有大量乙酸以及少量柠檬酸、草酸、酒石酸等酸性物质，这可能是该真菌具有高效解磷功能的原因之一。经形态学以及分子鉴定，初步确定该菌株为黑曲霉（Aspergillus niger）。土壤接菌实验表明，An-6可明显增加土壤中有效磷含量，有望开发为微生物磷肥。

关键词 解磷真菌;筛选;解磷机理;微生物磷肥

中圖分类号 S154.3 文献标识码 A

磷是植物生长中必不可少的营养元素之一，参与植物体内多种代谢活动。然而，土壤中磷的难溶性和难移动性，导致有效磷含量低，只占土壤中总磷含量的1%～5%，限制了植物的生长发育[1]。长期以来，人们通过施用化学磷肥来满足作物对磷的需求。长期施用磷肥，导致土壤板结、水体污染等环境问题[2];另一方面，磷矿资源开发利用粗放，造成资源浪费。据估计，我国磷矿资源开采仅能维持到2050～2060年[3]。因而，如何将土壤中难溶性磷转化为可溶性磷，提高土壤中磷的利用率是目前农业生产上迫切需要解决的问题。

土壤中含有多种微生物，可以使土壤中难溶性磷转化为可溶性磷，这些微生物被称作解磷菌或溶磷菌。此类微生物种类繁多，包括细菌、放线菌、真菌等[12]，尤其是真菌，其解磷效果是解磷细菌的几倍甚至更多，而且遗传性状更稳定[4]，近年来受到广泛关注。本研究从耐贫瘠作物——火龙果根际分离到一株解磷真菌，解磷效果良好，有望开发为解磷菌菌剂，增加土壤中有效磷含量，减少磷肥的施用量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品

植物根际是解磷菌在土壤中的主要存在部位[5-6]，故用于解磷真菌分离的土壤样品采自海南大学檐州校区农科试验基地火龙果园表层以下5～10cm火龙果根际，取后放置在实验室晾干备用。

另外，取有效磷含量较低的土壤供试解磷真菌解磷效果验证，该土壤有效磷含量为4.13mg/kg，全磷含量为967.97mg/kg。

1.1.2 培养基

无机磷液体培养基[4]：葡萄-10g，（NH4）2so40.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g， MgSO₄.7H₂O0.3g，FeSO₄.7H₂O0.03g， MnSO₄.7H₂O0.03g，Ca3（PO₄）₂5g，蒸馏水1000mL，调pH至7.0～7.5，分装，每瓶100ML，于121℃高压灭菌15min。

无机磷固体培养基：在无机磷液体培养基基础上加琼脂粉2%，于121℃高压灭菌15min。

解磷真菌固体发酵培养基：玉米秸秆25g，麸皮25g，（NH4）₂SO₄0.5g，MgSO₄0.125g，KH₂pO₄0.125g，加水50mL，装于1000ml，三角瓶中，121℃高压灭菌30min。

1.2 方法

1.2.1 解磷真菌的分离及初筛

将试验基地采回的土样晾干并研磨，过20目筛备用。称取10g研磨处理的土样于90mL的无菌水中，于28℃摇床中振荡培养30min，转速为150r/min。吸取1mL土壤悬浮液按照10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的梯度进行稀释，对最后3个稀释浓度各取200μL涂布于加有100μg/mL硫酸链霉素的无机磷固体培养基上，每个浓度3次重复，置于28℃的恒温箱中培养[7]。用无菌接种针挑取具有较大透明圈的单菌落转至PDA培养基上进行纯化，并于4℃冰箱保存备用。

用打孔器取解磷真菌菌落边缘菌块，接种在无机磷固体培养基中央，于28℃恒温培养箱中培养1周，测量菌落直径（d）以及解磷圈直径（D），并计算比值D/d，通过该比值的大小对分离到的解磷真菌进行初筛。

1.2.2 解磷真菌的复筛

将初筛获得的解磷真菌接种于PDA培养基上，28℃培养培养7d后收集分生孢子，并利用血球计数板计数。将收集的分生孢子接种在100ml，无机磷液体培养基中，调整浓度至10⁵个/mL，于28℃摇床中震荡培养，转速200r/min，7个重复。每天定时取样，每次取1瓶，测定发酵液pH，然后5000r/min离心10min后取上清，用钼锑抗比色法测定可溶性磷的含量[8]。

1.2.3 解磷真菌的分子鉴定

解磷真菌活化后收集菌丝100mg，利用天根一植物基因组DNA提取试剂盒提取gDNA，以引物对ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）为引物[9]，扩增rDNA-ITS序列，回收后送生工测序，将测序结果在NCBI数据库中进行比对。

1.2.4 发酵液中有机酸种类的测定

将第6天发酵液离心后获得的上清经0.45μm微孔滤膜过滤，利用高效液相色谱分析其中有机酸的种类及含量[10]。

1.2.5 解磷真菌对土壤解磷效果验证

参照1.2.2中方法收集解磷真菌分生孢子，并将收集的分生孢子接种在100ml， PD培养基中，调整分生孢子浓度至10⁵个/mL，于28℃摇床中振荡培养（转速200r/min），制备种子液。24h后取5ml，种子液并加无菌水至50mL，加入固体发酵培养基中摇匀，于28℃培养。一周后，将真菌固体发酵产物按质量分数1%、5%、10%（湿重）加入经高温灭菌的低有效磷土壤中混匀，装于营养钵中，每个营养钵400g，以不加菌土壤作为对照，每个处理3个重复。将营养钵放置于28℃，期间要保持土壤湿度。15d后将土壤自然风干，然后研磨过20目标准筛，利用钼锑抗比色法测定土壤中有效磷含量。

2 结果与分析

2.1 An-6具有较强的解磷效果

通过初筛，从火龙果根际土壤中分离纯化到一株具有解磷效果的真菌，命名为An-6。其菌落形态见图1-A，菌落中间黑色，边缘白色;光学显微镜观察菌丝为有隔菌丝，分生孢子梗顶端球状，分生孢子椭圆形。该菌株在无机磷固体培养基上具有明显的解磷圈（图1-B），解磷圈与菌落直径比值（D/d）为1.38（表1），表明该菌株具有较强的解磷能力。

将供试解磷真菌An-6接种在含有难溶性无机磷的液体培养基中，随着培养时间的延长，发酵液变得澄清（图2），可溶性磷含量逐渐增加，且在0～48h内增速较快（图3），在48h之后增速趋于平缓，当培养时间达到96h时，培养液中的可溶性磷含量达到最高值764.4mg/L，随后又有所下降，但降幅趨于稳定，可能是菌株开始衰老的结果，也可能是真菌将无机磷转化成为自身结构磷的结果。以上证明该真菌具有溶解难溶性磷的能力。

2.2 An-6解磷解磷机理初探

通过定时测定上述发酵液pH，发现发酵液pH逐渐降低（图3），且与可溶性磷含量呈极显著线性负相关，其线性方程为y=-229.2x+1275.4（r=-0.986，P<0.01）。解磷菌An-6的解磷能力可能是由于向周围环境分泌有机酸，从而降低了发酵液的pH。

通过高效液相色谱技术对解磷真菌An-6第6天发酵液中有机酸成分进行分析，发现发酵液中含有较多的乙酸和柠檬酸，浓度分别为1041.6mg/kg和63.6mg/kg，另外还有少量草酸和酒石酸（表2）。这些有机酸的分泌是发酵液中pH降低的主要原因，也是不溶性磷被溶解的原因之一。

2.3 解磷真菌An-6的分子鉴定

将获得的rDNA-ITS序列（PCR电泳见图4）在NCBI数据库中比对，发现该序列与黑曲霉（Aspergillus niger）同源性达99%，结合菌落形态（图1-A）以及显微观察，确定该菌为黑曲霉。

2.4 An-6对土壤解磷效果

解磷真菌An-6固体发酵物接种在有效磷含量比较低的土壤中，15d后测定有效磷含量。土壤中解磷真菌含量为1%（湿重，下同）时，解磷效果只有1.42%，当真菌含量增加到10%时，解磷效果增加到10.33%（表3）。土壤中解磷真菌含量越多，有效磷含量越多，说明真菌An-6在土壤中具有一定解磷效果，有望开发为解磷菌剂。

3 结论与讨论

火龙果是一种耐盐碱、耐贫瘠的热带、亚热带农作物，适应性极强，在多种生态环境下均可成功种植。为了提高土壤中磷的利用率，本研究对火龙果根际微生物进行筛选，通过解磷圈（D/d）测定分析，获得一株具有较强解磷能力的真菌，命名为An-6，经形态学及分子生物学鉴定，初步确定为黑曲霉。在以无机磷La₃（PO₄）₂为唯一磷源的液体培养基中，An-6对不溶性磷酸三钙具有强的溶解效果，培养96h后，培养液中的可溶性磷含量达到最高值764.4mg/L。

难溶性无机磷占土壤磷总量的大多数[11]，解磷微生物降解难溶性无机磷的机理很复杂，其中最普遍、也最被广泛接受的是有机酸理论[13-14]。本文对An-6的解磷机理进行了初步研究，发现培养液中可溶性磷含量与溶液pH呈显著负相关（P<0.01），并经高效液相色谱分析发现，发酵液中含有大量乙酸以及少量柠檬酸、草酸、酒石酸等酸性物质，这可能是An-6具有解磷功能的原因之一。

本文对An-6在土壤中的解磷能力进行了试验，将该解磷真菌的固体发酵物与土壤混合，经培养，该真菌可明显增加土壤中有效磷含量，说明An-6具有开发为微生物磷肥的潜能。关于解磷真菌An-6的解磷机理、在植物根际的溶磷机制及其发酵工艺、制剂配方等还需进一步深入探究，以为其在农业生产中推广利用提供理论指导。

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