肌细胞钙稳态的维持及模拟失重条件下钙稳态的改变

余 蕾， 赵雪红， 张静姝， 樊小力， 李雪萍， 朱娟霞

(1. 西安医学院 基础医学部， 西安 710021； 2. 湖北文理学院 医学院机能学部， 襄阳 441053； 3. 西安交通大学 医学部， 西安 710016)

Ca2+作为第二信使参与了肌肉收缩、腺体分泌、突触传递、受精、转录调控等众多生命活动的基本过程。正常的肌肉收缩即由Ca2+触发。细胞处于安静状态时，胞浆[Ca2+]i低于0.1 μmol/L，肌肉舒张；当肌细胞受到刺激兴奋时，肌质网释放Ca2+，胞浆[Ca2+]i迅速增加10～100倍，启动了兴奋-收缩耦联，Ca2+与肌钙蛋白结合，触发肌肉蛋白质构型改变，引起肌肉收缩；当兴奋终止时，肌质网上的钙泵水解ATP提供能量将胞浆中增多的Ca2+主动转运回肌质网，胞浆Ca2+浓度恢复正常，肌肉松弛。由此可见，钙稳态的维持对肌肉收缩功能具有重要作用。

Ca2+参与肌细胞活动的调节，肌细胞内的Ca2+极可能参与了细胞增殖的启动过程。在Ca2+作用下，c-myc，c-fos及细胞膜受体表达增多，肌细胞有丝分裂明显增加，肌细胞内出现蛋白质沉积，继而出现肌细胞肥大、增生。受其影响，还出现了肌细胞蛋白表型转换和幼稚型骨骼肌的生长[1]。近年来研究发现，模拟失重条件下骨骼肌细胞出现的肌球蛋白表型的转换、收缩功能减弱等情况均与骨骼肌细胞内钙稳态失衡有关[2-4]。本文针对钙稳态的维持及模拟失重条件下的钙稳态失衡与肌萎缩的关系及其可能的机制进行了综述。

1 钙稳态的维持

细胞内的钙包括结合钙、游离钙两部分，游离钙大部分为Ca2+。细胞内Ca2+浓度约为1.5 mmol/L，其中胞浆内的游离Ca2+浓度仅占0.01%。安静状态下的肌细胞胞浆中Ca2+浓度约为0.1 μmol/L。肌质网、线粒体等具有贮存Ca2+的能力，被称为钙库。钙库中的Ca2+浓度高于胞浆，以肌质网为例，肌质网中游离Ca2+浓度约为胞浆的5倍。

胞浆Ca2+浓度的调节可通过以下途径完成：胞外Ca2+通过电压门控钙通道、配体门控钙通道等离子通道进入胞内，使胞浆Ca2+浓度增高；胞内钙库释放钙。钙库表面存在着钙转运系统，能够摄取及释放Ca2+，对肌细胞胞浆钙浓度的调节起着重要作用。本文重点讨论钙库对胞浆Ca2+浓度的调节。

1.1 肌质网对胞浆Ca2+浓度的调节

骨骼肌收缩时所需要的游离钙大部分是由肌质网释放到胞浆中的。Ca2+通过肌质网上的雷尼定受体(ryanodine receptor, RyR)快速释放到胞浆中，引起肌肉收缩；而后又通过肌质网钙泵(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)由胞浆泵回肌质网，引起肌肉舒张。

RyR受体是肌质网的Ca2+释放通道。它位于肌质网膜上，是一种跨膜蛋白，其C端构成了Ca2+通道，N端可与胞浆中Ca2+结合。RyR受体有3种亚型：RyR1和RyR2主要存在于骨骼肌和心肌，在兴奋-收缩耦联过程中起核心作用；RyR3在骨骼肌中呈较低水平表达，其具体作用不详。以上3种亚型在哺乳动物脑中均有表达[5]。肌细胞受到刺激兴奋时，T管膜上L型钙通道构象发生改变，继而引发RyR1受体通道开放，触发肌质网释放Ca2+。胞浆Ca2+可调节RyR受体的开放状态，且具有双向性：当胞浆Ca2+浓度为1～10 μmol/L时，Ca2+促进RyR1的开放；而当胞浆Ca2+浓度增多至1～10 mmol/L时，则抑制RyR1的开放[6]。FK506binding-protein12(FKBP12)是RyR受体的结构稳定蛋白，cAMP可通过激活蛋白激酶A(protein kinases A，PKA)进而磷酸化RyR，从而使FKBP12从RyR受体上脱离，RyR构象改变，这时即便肌质网处于静息状态，RyR也会向细胞浆泄漏大量的Ca2+[7]。磷酸二脂酶(phosphodiesterase ，PDEs)同工酶超家族成员之一PDE4则可通过分解细胞内cAMP维持RyR受体结构的稳定性。亚硝基化可使RyR受体性质发生改变，FKBP12表达减少，从而使RyR受体通道开放次数增多，胞内静息Ca2+浓度增加，肌质网内Ca2+耗竭，肌肉收缩时表现为肌质网内Ca2+释放减少，肌肉收缩力减弱[8]。

肌质网摄取Ca2+主要通过SERCA实现。SERCA位于肌质网膜上，是一种四聚体阳离子转运ATP酶，它能够水解ATP产生能量，从而将胞浆内的Ca2+主动转运回肌质网。SERCA存在3种亚型，其中SERCA1主要在成年骨骼肌细胞中表达，它又包括1a和1b两种亚型，前者主要在快肌纤维中高表达，后者主要在慢肌纤维中高表达。SERCA2则常见于心肌和骨骼肌慢肌纤维中[9]。

1.2 线粒体对胞浆Ca2+的调节

细胞约有50% Ca2+储存在线粒体中，线粒体通过与Ca2+的结合，完成了氧化磷酸化过程，为肌肉活动提供所需能量。线粒体在胞浆Ca2+浓度的调节过程中扮演着重要角色，线粒体既能从胞浆摄取Ca2+，也能将其内部储存的Ca2+释放至胞浆。然而在生理条件下线粒体对细胞钙稳态的维持仅起辅助作用[10]。线粒体内膜上存在有线粒体Ca2+单向转运蛋白和线粒体Ca2+摄入蛋白1，它们都参与了线粒体对胞内Ca2+的调节过程。当胞浆Ca2+浓度异常增高时，胞浆内的Ca2+可借助线粒体Ca2+单向转运蛋白顺电化学梯度快速转运至线粒体，引起线粒体内Ca2+聚集；线粒体内的Ca2+可通过钠钙交换转出进入胞浆[11]。线粒体Ca2+摄入蛋白1还参与了SAH介导的钙超载[12]。研究发现，抑制线粒体Ca2+单向转运蛋白的表达，可减弱由Ca2+触发的细胞凋亡[13]。

2 模拟失重条件下钙稳态的改变及其对肌细胞的影响

Ca2+在细胞外液、胞浆、钙库之间不断移动，并在各部分维持着相对稳定的浓度，这便是钙稳态。钙稳态的维持涉及一系列复杂的机制，它是细胞能完成一系列生理功能和Ca2+信号生成与转导的基础。细胞内钙浓度增高达到钙超载时，可导致细胞结构损伤、功能障碍。研究发现细胞内钙超载与多种组织的细胞损伤及修复密切相关，如心肌、神经、肝脏等[15]。

以大鼠为研究对象进行模拟失重研究发现，模拟失重仅3 d，梭内、外肌细胞即出现了胞浆游离Ca2+浓度增多的现象；模拟失重14 d，梭内、外肌细胞胞浆出现钙超载现象，并可见到梭内肌纤维中钙结合蛋白D28K的表达明显减少，D28K与胞浆游离Ca2+的结合减弱，胞浆游离Ca2+增多，细胞抵抗钙超载的毒性作用减弱。说明模拟失重条件下肌细胞内Ca2+异常增多，且随模拟失重时间的延长而加重[3]。近期又有研究表明[15-16]，模拟失重时间超过4周，骨骼肌细胞RyR1 mRNA呈低表达，而肌质网SERCA活性及表达则显著增加，说明在长期模拟失重状态下，肌质网内的Ca2+释放减少而肌质网对胞浆Ca2+的摄取增多，提示随着模拟失重时间的延长，超载的Ca2+由胞浆向肌质网转移。

Ingalls等[17]发现，模拟失重7 d可引起骨骼肌线粒体钙超载，肌质网钙泵活性降低，肌质网摄取Ca2+明显减少，从而导致胞浆Ca2+大量堆积，肌肉收缩力减弱。在大鼠尾部悬吊动物实验中发现，吊尾第2天细胞内的Ca2+浓度升高38%，至第7天时升高117%，而肌肉的最大等长收缩力(P0)则分别下降24%和27%。研究资料表明，在失重状态下，骨骼肌的等长收缩持续时间减少，间断强直收缩的舒张时程、峰张力时间和半舒张时间减小，这与肌质网Ca2+释放和再摄取的数量与速度的改变有关，若提高肌质网释放和再摄取Ca2+的速率，则可提高肌肉的工作能力[18]。

模拟失重条件下，肌细胞内Ca2+浓度升高的同时，伴随着c-fos表达的显著增高和肌球蛋白重链亚型的转变，表现为IIa型肌球蛋白重链表达降低，而IIb型、IIx型肌球蛋白重链表达升高，推测胞内Ca2+浓度增加启动了c-fos的高表达，从而引起了肌球蛋白表型的转换[1,19]。胞外Ca2+内流增多或胞内钙库释放Ca2+所致的细胞胞浆Ca2+浓度异常增高，均可引发肌纤维的损伤，启动肌肉蛋白的分解。仅依靠肌质网释放Ca2+所致的胞内钙超载就可使肌肉收缩功能减退、甚至引起肌肉损伤。且Ca2+内流产生了肌梭电位、并触发了肌梭初级末梢释放递质，维持了感觉末梢的兴奋性，可见Ca2+与肌梭功能密切相关。据此我们认为，在失重/模拟失重环境下，梭内肌细胞钙稳态失衡或钙超载必然影响肌梭电位的产生，从而使肌梭传向中枢的冲动减少，肌紧张减弱，最终将导致或者加重肌肉萎缩。

3 模拟失重条件下钙稳态失衡导致肌肉萎缩的可能机制

3.1 水解蛋白质。高浓度Ca2+可激活Ca2+-依赖性的蛋白水解酶Calpains，从而引起肌细胞蛋白质降解。Calpains存在两种主要亚型，即Calpain-1(μ-Calpain)和 Calpain-2(m-Calpain)，且在骨骼肌Z线上呈现出密集分布。肌原纤维用Ca2+处理后可见到Z线被快速而完全的裂解[20]。胞内Ca2+浓度增加可通过激活Calpain-1，水解结蛋白、原肌球蛋白、肌联蛋白等肌原纤维蛋白。此外Calpain-1还可水解亲联蛋白，使得肌质网膜与T管连接的稳定性减弱，肌质网内Ca2+释放减少，最终导致肌细胞收缩功能下降、结构破坏，最终引发细胞凋亡[21-22]。梭内肌细胞内Ca2+浓度增加可通过激活Calpains而降解细肌丝的肌动蛋白，使横桥无法与肌动蛋白结合，肌肉无法收缩，从而导致梭内肌萎缩、收缩蛋白含量降低。研究发现，后肢去负荷5 d即可导致大鼠比目鱼肌细胞胞浆钙超载，且随着去负荷时间的延长，Calpain-1的活性及结蛋白降解逐渐增加，相邻肌原纤维的连接逐渐松散[23]。

3.2 线粒体功能障碍。细胞内钙超载可加强肌质网和线粒体对Ca2+的摄取，钙依赖性的ATP酶活动增多，从而使ATP的消耗增加；同时，线粒体摄取Ca2+后，Ca2+与线粒体内富含磷酸根的化合物相互作用形成磷酸钙沉积，影响ATP的合成[24]。ATP的合成不足和消耗增加，最终导致肌细胞收缩功能障碍。Ca2+超载情况下，钙依赖性磷脂酶被激活，水解生物膜中的磷脂骨架，增加了膜的通透性，进一步加剧了钙超载；同时，线粒体通透性转换孔大量开放，线粒体释放细胞色素C，Caspase-9、Caspase-3相继激活，启动了线粒体凋亡程序[25-27]。由此可见，高钙可引发线粒体功能障碍甚至导致线粒体凋亡。

图1 模拟失重条件下钙稳态失衡导致肌肉萎缩的可能机制的示意图

3.3 诱发凋亡。钙超载时可激活黄嘌呤代谢途径，产生大量氧自由基，氧自由基增多又可通过促进RyR受体通道开放而加重钙超载，并通过调节Bax与Bcl-2的比例而诱发细胞凋亡[28-29]。Calpain-1、Caspase-3、促凋亡因子Bid可被细胞内增多的Ca2+相继激活，继而引发Caspase-12降解，并诱发细胞凋亡。大鼠尾部悬吊2周即可出现Calpain-1与Calpain-2活性的增加，两者活性分别增加了1.5倍和4.3倍[29-30]。Calpastatin是一种内生的Calpain抑制剂，可抑制Calpain-1和Calpain-2的活性。Calpastatin过表达时，后肢去负荷10 d的大鼠肌肉萎缩程度减少30%，肌球蛋白亚型由慢向快的转变减少[28]。

4 结论

综上所述，肌细胞内钙稳态的维持为肌肉收缩舒张功能的实现提供了保障，骨骼肌细胞胞浆钙稳态失衡时，尤其是胞浆Ca2+浓度过度增加或持续性增加，可通过激活磷脂酶水解生物膜的骨架成分，增加生物膜的通透性；同时通过激活半胱氨酸蛋白酶Calpain水解蛋白质，引发肌细胞结构紊乱，从而影响肌肉的收缩与舒张功能。Ca2+浓度增加还可以激活细胞内溶酶体系统，使细胞内结构降解[28]。据此推断，失重/模拟失重条件下产生的钙超载可能是失重性肌萎缩发生的重要原因，钙超载通过破坏梭内外肌纤维结构而影响肌肉收缩功能，同时通过影响肌梭电位的产生，使肌梭传向中枢的冲动减少，肌紧张减弱，最终将导致或者加重肌肉萎缩。