研究生等温滴定量热实验课的教学探讨

张玉苹　裘令瑛　陶艳春

摘要：针对等温滴定量热技术是研究分子间相互作用的重要手段，在等温滴定量热实验课中，教师针对本单位的研究体系，从学生的角度出发，采用多种教学方式，重点向学生介绍仪器的注意事项、操作步骤、数据分析三方面内容，使仪器的价值得到充分发挥，更好地为科研工作者提供数据支持。

关键词：等温滴定量热；热力学；分子间作用；教学讨论

中图分类号：G643 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2018）49-0261-02

等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）是近年来发展起来的研究分子间相互作用的重要方法，其中包括蛋白和蛋白，蛋白和核酸，蛋白和小分子，蛋白和金属离子，靶分子和药物分子，酶和抑制剂，抗体和抗原等之间的相互作用[1-6]。ITC通过测定分子价键的打开和形成过程中吸收和释放的热量来获取分子间相互作用的定性和定量信息，如：结合常数（KD）、反应化学计量（n）、反应焓变（ΔH）和反应熵变（ΔS）等。由于此方法具有较高灵敏度、较好重现性、测试直接、无需标记等特点，被广泛的应用于基础科学研究和药物研发等多个领域[7，8]。目前，许多高校、研究所、药企也都将ITC作为研究分子间相互作用、确认药-靶结合和改造药物的黄金标准技术。随着国家对科学研究的资金投入，高校和研究所对贵重科研仪器的购买增多，如何高效使用等温滴定量热仪更好地服务于科研工作者，是科研单位需要认真思考的问题。下面结合实际经验，以ITC200型超微量等温滴定量热仪为例，从仪器的注意事项、操作步骤、数据分析三方面，谈谈如何对学生进行规范的等温滴定量热实验教学。

一、仪器的使用注意事项

将等温滴定量热仪对研究生开放使用，一方面能提高仪器的利用率，充分发挥仪器的使用价值；另一方面能促进学生与仪器亲密接触，及时获取实验数据，为开展高水平的科学研究奠定基础。由于等温滴定量热仪属于高端精密仪器，其原理及操作较为复杂，一旦操作使用不当，易造成仪器损坏，后果不堪设想，所以，有必要对每一位测试学生进行详细的仪器理论讲解与严格的上机操作培训。

首先，要让上机操作的学生掌握仪器的原理、结构组成，熟悉测试流程及详细的操作步骤，掌握数据的处理分析等。例如，ITC200型超微量等温滴定量热仪的组成部件主要包括塔台、注射针、反应滴定针、样品反应池、清洗样品反应池的小型机械泵、高速旋转的搅拌器、检测器、控制器、清洗用的溶液甁以及用于连接控制器的电脑等。其中，用于测试的反应滴定针由石英玻璃制成，易破碎，使用前应仔细检测是否破裂，测试过程中，谨记轻拿轻放，将金属接头插入固定支架上的链接孔时，轻轻拧紧即可，切勿用力拧死。比如，实验前应确认样品池、参比池、注射器等部件的干净，一定要依次用甲醇、蒸馏水、缓冲液对它们进行清洗，在水滴水实验的噪音水平达到测试要求后才可以开始测试样品。

其次，介绍正常仪器操作中可能出现的异常情况，这些情况的出现不仅会影响仪器的状态，还会对实验数据以及后面的学生的实验造成影响。比如仪器设备要求环境洁净且无震动，测试时人为带来的强光、气流波动、仪器震动等，都将会影响测量结果，产生测试误差。再如，严禁学生私自使用U盘拷贝数据，一旦有病毒带入将会导致主机瘫痪，造成实验数据丢失甚至重装仪器控制软件的风险，这将会影响学生的数据采集和科研成果的发表，所以我们要求学生用光盘刻录存储数据已保证仪器的正常使用。以上事例要反复强调，否则会对学生、老师及实验室造成极大的影响。

二、测试操作步骤

为了让学生更加明白仪器的组成与原理、测试流程、操作方法、注意事項等，教师应采用理论与实践相结合的方式，通过测试某一样品为例详细讲解，提高教学效果。下面以美国通用电气公司生产的ITC200型超微量等温滴定量热仪为事例展开讨论，具体测试操作步骤如下。①采用水滴水实验，确认仪器样品池是否干净。②选择合适的缓冲液，准备待测样品。③根据待测样品特性进行实验设计，由仪器软件给出预估实验结果图，以及推荐使用的样品浓度。④样品池加样、参比池加超纯水、滴定注射器加样。⑤设置实验参数（如总注射次数、样品池温度、滴定时间间隔、搅拌器转速、单次滴定体积、两次滴定的时间间隔、数据输出频率）。⑥测试结束后，保存实验数据文件和实验参数文件，并重复步骤1做好仪器的清洁。

实验的成功主要取决于两点：一是仪器的干净程度，二是待测样品的配制。教师应详细介绍如何确认样品池是否干净。比如，先向样品池、参比池、滴定注射器加入超纯水，接着采用水滴水的实验确认是否干净，只有噪音水平达到测试要求才可以开始测试样品。若样品池太脏可采用去垢剂、高温泡洗。准备待测样品时，教师需重点强调滴定物与被滴定物间的缓冲液、pH、盐浓度、DMSO浓度等保持完全一致，并且要在同一缓冲液中透析或者置换大分子和配体。虽然DMSO对小分子有助溶效果，但也要控制量，最好不要超过5%，不然会破坏蛋白，对于水溶性太差的样品，可借助超声、加温、调pH等方法。在确定样品浓度后，依次对样品池、参比池、滴定注射器加样。此部分内容不仅要详细介绍，还要有教师与学生的互动，通过理论与实际动手操作，让学生掌握加样的流程与细节。实验结束后，在Setup模式下分别点击Data File Path与Setup File Path中的文件夹名称，保存实验数据文件和实验参数文件。然后取出样品池中的样品，做好样品池和滴定注射器的清洗。

三、数据处理分析

等温滴定量热法直接测量的是生物化学结合过程中释放或吸收的热量，通过计算给出结合常数（KD）、反应化学计量（n）、焓（ΔH）和熵（ΔS）。因此，可以结合实例介绍数据分析的步骤，让学生掌握数据处理分析的方法，尤其是如何扣除背景部分。具体的数据分析步骤如下：①将ITC实验结果文件导入Origin软件；②对原始数据进行积分，并删除错误的点数据；③利用点对点或最后几个点扣除背景，并运用合适的结合模型拟合数据；④观察拟合效果，利用软件计算得出结合常数（KD）、反应化学计量（n）、焓（ΔH）和熵（ΔS）。在讲解此部分内容时，如何扣除背景应重点强调。如点对点扣除背景时，“Cell Vol”样品池体积的数值是不能更改的。再如用最后几个点扣除背景时，需先观察NDH的最后4—5滴的结果，与参照实验结果类似且数值稳定后，方可进行后续处理。在选择模型拟合数据时，应将技巧介绍给学生，如反复多次点击直至Chi-Sqr值不再减小为止，以此提高拟合效果。对于拟合效果不好时，应重点讲解如何处理，比如调整滴定物或者被滴定物的浓度，重新实验以达到好的拟合效果。

四、结束语

等温滴定量热技术是研究分子之间相互作用的重要手段，高速地推动着生物动力学与热力学的蓬勃发展，尤其是在研究药物—蛋白、蛋白—蛋白、酶催化等方面。作为实验课教师应该针对科研单位的研究体系，从学生的角度出发，采用多种教学方式，安排实验教学内容，使等温滴定量热仪的价值得到充分发挥，并更好地为科研工作者提供有力的数据支持。

参考文献：

[1]黄卓楠.微量量热技术测定酶催化反应的研究进展[J].分析仪器，2013，（5）：1-5.

[2]娄朋晓，王玉洁，白光月，等.表面活性剂分子间弱相互作用的直接能量表征——高灵敏等温滴定量热法[J].物理化学学报，2013，29（7）：1401-1407.

[3]齐心洁，王玥，王彦晟，等.等温滴定量热法在蛋白质-配体相互作用中的应用[J].生物技术通报，2017，33（5）：40-49.

[4]石会刚，陈东戎.等温滴定量热法研究核糖开关aac与氨基糖苷类抗生素的相互作用[J].生物物理学报，2015，31（3）：241-250.

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[6]张慧.等温滴定量热法和荧光淬灭法測定DPF2与抗癌药物的结合作用[D].武汉：华中师范大学，2016.

[7]李桐，张昊，田学浩，等.基于等温滴定量热技术探究黄芩质量表征新方法[J].中国中药杂志，2017，42（20）：3969-3973.

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