河南省猪源大肠杆菌ESBLs基因型检测及耐药性分析

张青娴 ，徐引弟 ，王治方 ，朱文豪 ，焦文强 ，李海利 ，方剑玉 ，郎利敏 ，张立宪 ，游 一 ，许 峰 ，郑万录 ，王克领

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南郑州450002）

β-内酰胺类抗菌药物是化学结构中含有β-内酰胺环的一大类抗生素，包括青霉素类、头孢菌素类和其他β-内酰胺类，此类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效好等优点。其主要作用机制是产生能抑制细菌细胞壁的黏肽合成酶（又叫青霉素结合蛋白，PBPs），从而阻碍细胞壁黏肽的合成。产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs） 是肠杆菌科细菌对 β-内酰胺类抗生素耐药的最主要机制，其中，大肠杆菌是ESBLs最主要的产生菌。ESBLs基因型众多，根据质粒编码基因和ESBLs优先水解底物的不同主要分为CTX-M型、TEM型、SHV型、OXA型和其他型等[1-6]。

为了解河南省猪源ESBLs大肠杆菌对β-内酰胺酶的耐药性流行情况，本试验对河南省农业科学院畜牧兽医研究所传染病研究室2018年1—4月所分离的70株大肠杆菌进行药敏试验和耐药基因的相关检测，采用CLSI推荐的表型筛选和确证试验检测大肠杆菌携带ESBLs情况，用PCR方法检测ESBLs 基 因（blaCTX-M，blaTEM，blaSHV，blaOXA）的流行分布情况，旨在为兽医临床ESBLs大肠杆菌耐药性的评估与治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2018年1—4月，从河南省规模化猪场采集有腹泻症状的猪肺脏、气管等组织，通过细菌培养、纯化和PCR检测等方法共获得70株大肠杆菌。

1.1.2 试剂和培养基 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（tryptic soybroth，TSB）购自 Difco公司。麦康凯（MC）琼脂、普通营养琼脂、苗勒-欣顿（MHA）琼脂、革兰氏染色液等购自北京奥博星生物公司。药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。Taq PCR master mix，DL2000 DNA Marker等PCR试剂购自宝生物（大连）有限公司。DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒等购自上海生工生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ESBLs大肠杆菌耐药表型菌株测定 参照2017年美国临床和实验室标准化协会（Clinical and LaboratoryStandards Institute，CLSI）推荐的双纸片法进行[7]。

1.2.2 药敏试验 采用K-B法测定ESBLs分离菌株对18种常用抗菌药物的敏感性。所用药敏纸片包括：阿米卡星（AK）、四环素（TE）、氨苄西林（AMP）、阿莫西林（AMX）、卡那霉素（K）、氧氟沙星（OFX）、头孢噻呋（EFT）、恩诺沙星（ENR）、头孢唑林（CZ）、复方新诺明（STX）、新霉素（N）、头孢哌酮（CFP）、氟苯尼考（FFC）、链霉素（S）、庆大霉素（GM）、环丙沙星（CIP）等。

1.2.3 PCR方法检测ESBLs大肠杆菌基因型 参照GenBank已发表的基因序列，设计5对特异性引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列为：CTX-M，F 5′-AAAAATCACTGCGCCAGTTC-3′，R5′-AGCTTATTCATCGCCACGTT-3′；OXA，F5′-AT GAAAAACACAATACATATCAACTTCGC-3′，R5′-G TGTGTTTAGAATGGTGATCGCATT-3′；TEM，F5′-C ATTTCCGTGTCGCCCTTATTC-3′，R5′-CGTTCATCC ATAGTTGCCTGAC-3′；SHV，F5′-AGCCGCTTGAGC AAATTAAAC-3′，R5′-ATCCCGCAGATAAATCACC AC-3'；DHA，F5'-TGATGGCACAGCAGGATATTC-3′，R5'-GCTTTGACTCTTTCGGTATTCG-3'。

将经ESBLs确证试验的30株ESBLs大肠杆菌菌株分别接种TSA平皿，37℃温箱内培养18 h后，挑取单个菌落，置于100 μL灭菌超纯水中，旋涡混匀，100℃煮沸10min后12000r/min离心10min，取上清提取DNA作为PCR模板备用。

PCR 体系为：13 μL Taq PCR master mix，1 μL上游引物，1 μ 下游引物 2，5 μL 菌液，5 μL ddH2O，进行PCR反应，取PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳。

2 结果与分析

2.1 ESBLs大肠杆菌耐药表型测定结果

70株大肠杆菌双纸片法一共鉴定出30株ESBLs菌，其中，肺脏20株，脾脏1株，气管5株，关节1株，有3株分离自心脏。区域分布基本覆盖全省较多地市，无明显地域性差异。

2.2 药物敏感性试验结果

药敏试验结果按2017年CLSI[7]的标准判断，结果如表1、图1和表2所示。

表1 大肠杆菌分离株的药敏结果 mm

续表1 mm

由表1可知，30株 ESBLs菌有6株（36，45，48，67，69，70号菌株）对CAZ耐药，并非 100%敏感，而对CTX耐药的则有 11 株（菌株32，36，38，42，45，48，50，51，60，61，64 号），说明用 CTX检测 ESBLs菌的敏感性高于CAZ，且纸片法测定的ESBLs菌不一定对CAZ和CTX耐药。

从图1和表2可以看出，大肠杆菌ESBLs菌对常用药物的耐药率均超过70%，全部为14种耐药以上，且17种和18种耐药共20株，占ESBLs菌的66.7%。对常用药物尤其是头孢类药物耐药，其耐药谱平均耐16.8种药，要高于非ESBLs菌。ESBLs菌和非ESBLs菌耐药率差异最大的为头孢类药物，即EFT，CZ，CFP，CAZ和 CTX。

表2 大肠杆菌分离株的耐药谱

续表2

大肠杆菌非ESBLs菌耐药谱均为7种以上，13种及以上耐药菌株有23株，占总数的57.5%。所分离的非ESBLs菌平均耐13.1种药，对常用18种药物除头孢类外，对其他氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、青霉素类、磺胺类和氯霉素类等均表现出高于60%的耐药率，说明大肠杆菌的耐药性较高，且均为多重耐药。

2.3 大肠杆菌ESBLs耐药基因PCR扩增结果

分别扩增30株ESBLs菌的CTX-M基因、TEM基因、OXA基因、SHV基因和DHA基因，阳性基因型片段均与预期设计相符合，PCR扩增结果如图2～4和表3所示。CTX-M基因型扩增结果表明，预期条带大小为415 bp（图2）；TEM基因型扩增结果表明，预期条带大小为800 bp（图3）；SHV基因型扩增结果表明，预期条带大小为713 bp（图4）。扩增出与预期设计相符合者为阳性，其中，阳性率分别为CTX-M53.3%，TEM66.7%，SHV3.3%，未扩增出OXA，DHA基因。

表3 耐药基因的PCR扩增结果统计

从表3可以看出，30株ESBLs菌株除3株未扩增出ESBLs耐药基因外，同时携带有CTX-M和TEM基因型的为9株，占30%，同时携带CTX-M和SHV基因型的有1株，其余菌株均含有1个耐药基因，含CTX-M基因型菌株检出率为53.3%，含TEM基因型菌株检出率为66.7%，为本试验分离株的优势基因型。

3 讨论

病料分离结果证明，来自于肺脏、脾脏、关节和气管的ESBLs大肠杆菌药敏试验和耐药基因检测无明显规律性。

药敏试验证明，所分离的30株ESBLs菌对头孢类的耐药率并非是100%，部分菌株表现出对该类药物敏感，但是ESBLs菌具有体外敏感而体内耐药的特点，故不能仅通过体外药敏试验结果来指导临床用药[8]。大肠杆菌ESBLs株分离率为42.8%，低于苑丽等[8]的76.7%，而高于大多数研究者的分离率[7-11]，可能说明近年来大肠杆菌ESBLs菌的分离率呈增长趋势，也说明头孢类药物在临床上的应用和耐药率越来越高。而非ESBLs菌对各类抗生素的耐药率也在60%以上，且耐药谱13种以上的居多，说明河南省大肠杆菌的耐药性很高，且均为多重耐药。

我国分离的ESBLs大肠杆菌基因型主要以CTX-M型为主，河南省农业科学院畜牧兽医所传染病研究室所分离的ESBLs大肠杆菌则以CTX-M型和TEM型为主，这与国内大多数学者的研究结果一致[5-6，7-12]，但未扩增出同时存在2种以上基因型的菌株。而欧美国家以TEM型和SHV型为主，葡萄牙动物源性ESBLs大肠杆菌基因型则以TEM-1，OXA和SHV为主；西班牙动物源性ESBLs大肠杆菌基因型流行TEM-1，SHV-1和OXA型，不同国家和地区流行的ESBLs大肠杆菌耐药基因不同与本地区抗生素的使用方法、种类和数量等因素有关[13-16]。

ESBLs大肠杆菌不仅含有ESBLs耐药基因，还同时携带有其他耐药基因[16-17]。BATCHELOR等[17]研究表明，介导β-内酰胺类药物的耐药基因常常与介导氨基糖苷类、氯霉素类和磺胺类药物的耐药基因在同一质粒上，导致耐药性的共选择（Co-selection）和共同播散，即其他药物（如氨基糖苷类、氯霉素类或磺胺类药物）的使用，可能会使β-内酰胺类药物的耐药性选择出来。河南省ESBLs大肠杆菌耐药基因以CTX-M和TEM为主，且分离率逐渐增高，说明养殖企业使用头孢噻肟和头孢他啶类药物的频率正在逐年增加，会导致今后养殖业用药越来越困难。由于耐药基因的宿主可转移性，随之会产生人类公共卫生安全隐患，应研制出中药等其他替代药物，减少第3代抗生素的大规模使用，以免给人和动物的健康带来重大影响[18-22]。