基于ITS 和LSU序列对一株野生鹅膏菌的分类鉴定

渠文思，石家祺，石亚伟

（1.山西大学生物技术研究所，山西太原030006；2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018）

鹅膏菌在真菌界属于担子菌门担子菌纲伞菌目鹅膏菌科鹅膏菌属[1]。鹅膏菌属是世界性的大属，目前，全世界该属有1 000个名称[2]，但被接受的约600种[3]，其中，我国已经报道的有 110多种[4]，既有可食用的鹅膏菌，如橙盖鹅膏菌（Amanita caesarea）、卵盖鹅膏菌（Amanita ovoidea）、红黄鹅膏菌（A－manita hemibapha）等，也有含毒的鹅膏菌，如黄绿毒鹅膏菌（Amanita phalloides）、暗花纹毒鹅膏菌（A－manita fuliginea）、鳞柄白鹅膏菌（Amanita virosa）等[5-6]，其中，红黄鹅膏菌不仅营养美味，其含有的多糖还具有抗肿瘤和增强免疫的作用[7]；鳞柄白鹅膏菌在欧洲、北美被称为“DestroyingAngel”（毁灭天使），其毒性极强，食用一小株就可能致人死亡。而且，大多数鹅膏菌属与维管植物形成专性外生菌根关系，是树木生长发育不可或缺的重要因子，在生态系统中发挥着重要作用。

传统的真菌鉴定和分类主要依据形态特征，包括子实体菌盖、菌柄、菌托和菌幕的不同形态特征以及孢子类型和孢子有性态[8]。但是通过形态观察极易混淆，再加上人为观察主观因素的影响，不能充分地反映出物种的进化关系。我国幅员辽阔、气候多变，地形多种多样，土壤也有多种类型，因此形成大量丰富的植被和森林，众多的鹅膏菌与不同植被共生，在长期协同进化过程中，形成了东亚所特有的鹅膏菌。我国部分鹅膏菌虽然与欧美的相似种外貌相似，但是内部结构和分子生物学鉴定差别较大，经常被误定为相同的种[9]。例如，东亚所特有的黄盖鹅膏菌白色变种（Amanita subjunquillea var alba）[10]被误认为是欧洲的鳞柄白鹅膏菌（Amanita virosa）。所以，在以形态特征为基础的前提下，还需要辅以rDNA的内转录间隔序列（Internal Transcribed Spacer，ITS）和大亚基序列（Large Subunit，LSU）分析以及DNA中GC含量测定等分子生物学鉴定方法。

本研究在形态学分析的基础上，利用PCR技术，扩增相应的rDNA的ITS和LSU序列并连接在T载体上，进行DNA序列测定，通过GenBank进行同源性检索比对，最后通过MEGA（version 5.1）软件构建系统发育树，旨在为野生鹅膏菌的鉴定提供分子依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 供试鹅膏菌子实体采自山西左权县。新鲜子实体采集后去除泥沙杂物，晒干至恒质量。

1.1.2 主要试剂 DNA纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒（北京索来宝科技有限公司），PCR扩增试剂（北京全式金科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 子实体基因组DNA的提取及检测方法 选取子实体中含有菌褶的菌盖部分来提取DNA，提取方法采用SDS-CTAB法[11-12]，以提取的基因组为模板扩增得到目的基因，采用胶回收试剂盒进行基因组DNA纯化。基因组DNA的检测利用1%的琼脂糖凝胶电泳进行。

1.2.2 rDNA的ITS和LSU基因序列的PCR扩增疑似鹅膏菌子实体ITS和LSU基因序列的PCR扩增分别使用的引物序列列于表1。

表1 用于PCR扩增的引物

ITS和LSU的PCR扩增反应体系为：ddH2O 13 μL，10×Easy Taq Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2.5 μL，10 μmol/L Forward primer/Reverse primer 引物各 2.5 μL，DNA 模板 2 μL，Taq DNA Polymerase 0.5 μL，总体积 25 μL。

扩增反应在美国MJ Research公司生产的扩增仪上进行。扩增条件为：95℃预变5 min；95℃变性 30 s，55℃复性 30 s，72℃延伸 1 min，共 30个循环；最后于72℃保温10 min。然后使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR的扩增产物，采用上海复日科技有限公司的SDS凝胶成像系统摄取扩增图谱。

1.2.3 rDNA片段克隆和测序 将扩增得到的目的基因连接到pEASY-Blunt Zero Cloning Vector载体上，转化到Trans1-T1感受态细胞中，利用通用引物M13F/M13R进行菌落PCR筛选，得到阳性重组子，挑取阳性克隆交于北京六合华大基因生物技术有限公司进行DNA测序。

1.3 数据分析

采用MEGA（version 5.1）软件中的最大似然法进行系统发育树的构建和分析，选择系统发育树中的自展值（bootstrap）为1 000次。

2 结果与分析

2.1 对鹅膏菌子实体ITS和LSU的PCR扩增及测序

以鹅膏菌子实体的基因组DNA为模板，对其中的ITS和LSU片段进行PCR扩增，扩增结果如图1所示。

由图1可知，用引物ITS1/ITS4和LROR/LR5都成功地扩增出一条清晰的条带，ITS序列长度为500～750 bp，LSU序列长度为750～1 000 bp。

2.2 rDNA ITS和LSU的测序及序列分析结果

由表2可知，山西左权鹅膏菌，ITS序列长度为666 bp，LSU序列长度为968 bp；ITS序列的GC含量为42.49%，LSU序列的GC含量为48.14%。一般认为，供试的rDNA序列与NCBI的GenBank数据库里序列BLAST比对后，序列相似性≥99%，可以认为属于同一种；序列相似性在95%～99%，可以认为属于相同属；序列相似性≤95%，可以认为属于不同的属[13]。将鹅膏菌子实体得到的rDNA的ITS和LSU序列与NCBI的GenBank数据库进行检索比对，确定与左权野生鹅膏菌最相似物种为拟橙盖鹅膏菌。

表2 鹅膏菌子实体rDNA的ITS和LSU序列分析结果

2.3 系统发育树结果分析

对疑似鹅膏菌子实体的ITS和LSU序列，连同从GenBank下载的相似序列一起进行系统发育分析。系统发育树分支下方的数值为支持值（bootstrap），构建得到的系统发育树如图2，3所示。

由图2可知，将子实体的ITS序列连同Gen-Bank数据库上下载的7个相似物种共8个ITS序列通过最大似然法做系统发育树，山西左权鹅膏菌与其最相似物种（GenBank：LC056756）以 100%的支持率聚在一起。

从图3可以看出，将子实体的LSU序列连同GenBank上下载的7个相似物种的LSU共8个序列用同样的方法做系统发育树，山西左权鹅膏菌与其最相似物种（GenBank：LC056746）以98%的支持率聚在一起。通过ITS序列和LSU序列做出的系统发育树，鹅膏菌都以极高的支持率与拟橙盖鹅膏菌聚在一起，所以将山西左权鹅膏菌初步鉴定为拟橙盖鹅膏菌（Amanita caesareoides）。

3 讨论

ITS和LSU序列常用来进行真菌鉴定，其中ITS称为内转录间隔区，是真菌rRNA基因非转录区的一部分[14]。ITS的真菌鉴定序列包括ITS1，5.8S和ITS2区。由于ITS序列在关系密切的物种间的长度变化不大（高等真菌一般小于1 000 bp），而且序列在进化过程中速率较快，因此，ITS序列经常用在属及属下水平做关于分类鉴定和系统发育研究[15-16]。LSU核糖体大亚基为核糖体大亚基序列，是位于28S的RNA序列。nLSU编码核糖体大亚基广泛用于真菌属以下组分之间和高级分类成员间关系的研究[17]。本研究基于rDNA的ITS，LSU序列2个指标对来自山西左权的野生的疑似鹅膏菌进行分子鉴定。

通常使用的建树方法分别是距离法、最大简约法和最大似然法，理论上虽然最大似然法计算强度最大，但在系统发育分析方法中是最为有效的方法，所以本研究选用最大似然法构建系统发育树[18]。无论以ITS扩增片段还是以LSU扩增片段构建的系统发育树结果，均能准确地反映本试验所鉴定野生菌株与拟橙盖鹅膏菌最为相近。

拟橙盖鹅膏菌（Amanita caesareoides）主要分布在我国、日本和俄罗斯远东地区，在形态上类似于橙盖鹅膏菌（Amanita caesarea）和红黄鹅膏勤务（A－manita hemibapha）[19]。在分子分类鉴定中它们也常常聚在一起。2个系统发育树结果也都显示与红黄鹅膏（Amanita hemibapha）亲缘关系最近，其中，rDNA的ITS序列以100%的支持率聚在一起；rDNA的LSU序列以98%的支持率聚在一起。Amanita caesareoides的菌盖是血红色至橙红色，一般为70～125 mm；菌褶离生至近离生；而菌柄是淡黄色到黄橙色，有时带有红色或橙色的纤维或斑块，其形状为圆柱形，向上渐窄；菌托为囊状、球状至近球状，其外表面为白色。Amanita caesareoides具有从近球形到椭圆形的孢子，与Amanita caesarea相比，其颜色非常明亮[20]。山西左权属于太行山区，未曾见拟橙盖鹅膏菌属的报道，本研究是首次采到拟橙盖鹅膏菌，通过形态学比较，结合分子生物学对其进行了鉴定。拟橙盖鹅膏菌在太行山区的采集和鉴定，丰富了山西野生真菌资源。