玉米野生近缘种抗虫基因的挖掘
2018-12-11刘耶玲杨利艳
刘 昊 ，宁 丹 ，刘耶玲 ，杨利艳
（1.山西师范大学生命科学学院，山西临汾041000；2.山西师范大学现代文理学院，山西临汾041000）
玉米（Zea mays ssp.mays），源于墨西哥至秘鲁一带，属于禾本科玉蜀黍属（Gemus Zea）的一个重要亚种，在我国俗称苞谷、苞米等。早在7 000多年前，印第安人就已经开始种植玉米，在哥伦布发现新大陆后将玉米引进到西班牙，玉米开始被带往世界各地栽培[1]。玉米野生近缘种在严酷的生存竞争和自然选择条件下形成了许多优良特性。大刍草（Zea mays ssp.parviglumis）又称墨西哥类玉米，形似玉米，喜高温、高湿、高肥环境，具有较高的再生能力，其分蘖性强，根系发达，抗病、抗逆境胁迫能力强[2]，是挖掘玉米抗虫基因的优良基因库。
对玉米驯化进行探索的先驱DOEBLEY及其同事于1984年用同工酶检测的方法对玉米及大刍草群体进行了区分[3]，排除了 Zea luxurians，Zea perennis，Zea diploperennis与其他大刍草群体为玉米直系祖先的可能性。BUCKLER等于1987年用核糖体内转录间隔区（Ribosomal internal transcribed spacer，ITS）序列多样性的方法对大刍草群体与玉米进行了多样性分析[4]，结果显示，Zea mays ssp.parviglumis是与玉米亲缘关系最近的大刍草亚种。目前为止，通过生化及分子生物学分析已经确定Zea mays ssp.parviglumis就是玉米的直系祖先[5]。
本研究旨在通过分析玉米和大刍草对黏虫取食前后转录组的响应，挖掘有应用前景的抗虫基因，为培育抗虫玉米提供基因源。
1 材料和方法
1.1 材料
玉米黏虫又名东方黏虫（Mythimna separate），刚孵化的黏虫由中国农业科学院植物保护研究所提供。供试大刍草Balsas teosinte（Zea mays ssp.parviglumis）（Packet#42833，13GH-GH 45-6 OP），由美国威斯康星大学遗传系JOHN DOEBLEY教授提供。供试玉米自交系B73种子由中国农业科学院生物技术研究所提供。
1.2 试验方法
试验于2017年8月在山西师范大学生命科学学院培养室进行。
1.2.1 黏虫饲养 黏虫孵化后置于放有新鲜玉米（先玉335）叶片的培养瓶中进行饲养，至3龄进行黏虫取食试验。
1.2.2 植物材料处理 花盆里播种玉米B73种子，当长出2片叶时，置于光照培养箱中进行培养，光暗周期16 h/8 h，温度为20～28℃，相对湿度65%～80%。至第3完全叶展开时，分别取长势一致且健壮的植株进行黏虫取食处理，每株幼苗为1个重复，每组设置3个重复。用毛笔粘取三龄黏虫均匀放置于植株上，每株接种4头黏虫，以不接虫材料为对照。玉米组材料分别标记为M0和M12；大刍草分别记为P0和P12（0为接虫0 h；12为接虫12 h）。
1.3 RNA提取与数据评估
培养玉米和大刍草至三叶期，分别提取接种黏虫处理0，12 h的同叶位材料，每组3个重复，提取总RNA并进行二代测序，对测序的原始数据通过FastQC进行质量估计，分别采用Trimmomatic进行质量剪切，得到相对准确的有效数据，以保证使用合格的样品进行转录组测序。
采用Illumina Hiseq技术对用黏虫处理的大刍草和玉米进行高通量测序，每个样本得到约500万个reads片段，包含近8亿的序列信息。经过测序质量控制，得到87%的干净数据，Q30碱基百分比高于95%，GC%含量平均值约64%。使用Trinity软件对样本转录组进行组装，组装共得到31.59万条Transcripts和10.59万条Unigene。Transcript和U-nigene的N50长度分别为1 267，1 112 bp，平均长度分别达到了847.95，729.23 bp，组装完整性较高（表 1）。
表1 RNA转录组数据
2 结果与分析
2.1 差异表达分析
在表达差异分析中，对差异分析结果进行可视化，为了得到显著差异的基因（表2），根据q值（qValue）＜5且差异倍数（Fold change）＞2的标准进行筛选，结果如表2所示。并制作火山图对差异基因进行差异基因可视化分析，结果如图1所示。
表2 部分差异表达基因表达量分析
2.2 差异基因功能注释
为了对所获得的转录组数据进行功能分析，将基因进行GO注释之后，将注释成功的基因再进行差异基因Gene Ontology（GO）分类。共有26 592个Unigene获得至少一个注释结果，这些Unigene被划入生物学过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cellular component，CC）、 分 子 功 能（Moleculer Function，MF）3个大类。其中，生物学过程与抗虫性密切相关，玉米和大刍草差异表达基因注释到生物学过程的比例如图2，3所示。
2.3 差异基因功能富集分析
在基因富集分析中，进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，当矫正后的q值＜0.05时，认为该功能存在显著富集情况；结果发现，13组基因功能；经GO基因功能注释分析之后，在KEGG富集通路中，对通路上的差异显著基因进行记录，初步筛选出大刍草中显著上调而玉米中不表达或表达极微小的基因。
2.4 抗虫候选基因筛选
在本试验中，对接种黏虫处理0，12 h的玉米和大刍草的叶片，通过差异表达基因GO功能和KEGG通路分析，结合表达量分析，初步筛选出DBT，HrpA，CYP86，cysK 和PPA 这 5个抗虫候选基因，这5个基因在大刍草中表达量远高于其在玉米中的表达。
3 结论与讨论
近年来，我国在玉米抗生物胁迫基因挖掘及功能分析、玉米转录组蛋白质和代谢组研究等方面取得了重要进展。病虫害是影响玉米生产的重要因子，会影响玉米品质和产量。目前已经发现的玉米中具有抗生物胁迫的基因有qRfg1，qRfg2等大量QTL 位点[6]。
转基因技术为拓宽基因的来源，提高育种的选择效率，加快育种进程提供了有效的方法。在抗虫转基因的研究中，明确记载了DBT418基因为抗虫基因，孟山都公司开发了包括DBT418在内的多价抗虫转基因产品（转化事件为DBT418×cry1AC×bar×pinll）[7]，因此，推测 DBT 基因家族具有抗虫性。
Hrp基因簇存在于大多数植物病原细菌中[8]，Hrp突变体的遗传学研究表明，Hrp基因簇通常由多个转录单位组成。对Hrp基因的表达和调控的研究表明，Hrp基因在营养丰富的复杂培养基中培养时不表达或者表达水平低，而在基本培养基中培养或在非组培条件下生长的植物组织中则大量表达，并发现HrpA基因参与识别外植物环境信号[9]。本试验中，HrpA基因在玉米中注释为mRNA前剪切因子ATP依赖性RNA解旋酶，推测其可能在玉米抗虫代谢中起作用。
CYP是参与除草剂代谢第一阶段的重要酶系，对作物对除草剂耐药性及敏感性的形成过程发挥着重要作用。生物学信息分析表明，玉米基因组中包含249个全长CYP基因，可分为8个基因簇（CYP51[10]，CYP71，CYP72，CYP85，CYP86，CYP97，CYP710及 CYP711）38个家族。通过与 KEGG pathway数据库比对，34个CYP蛋白被注释到次生代谢的生物合成、代谢、苯基丙酸类合成及类黄酮生物合成等16条生物通路上。在拟南芥基因功能的研究中发现，细胞色素P450 CYP86A1[11]编码一种脂肪酸omega-羟化酶，参与亚硒酸单体的生物合成。在拟南芥的根中，在内胚层和皮下组织的细胞壁或周皮中都能发现底物。由底物组成的脂肪屏障完成了限制水分和养分流失、防止病原体入侵的挑战，并对拟南芥抗干旱胁迫具有重要意义[12]。根轴上底物含量和组成的一些差异，说明了omega-羟基化在底物合成中的重要作用。细胞色素P450脂肪酸omega羟化酶CYP86A1[13]（At5g58860）是拟南芥脂肪根亚基合成的关键酶，因此，CYP86基因在植物逆境胁迫中具有重要作用。
cysK基因是参与Cys和Met代谢调控中的关键基因，后者参与甲硫氨酸合成路径和牛磺酸路径[14]。Cys基因簇在NCBI中的蛋白质注释为2-过氧化氢还原蛋白BASS1，多存在于粳稻群体中。
在对转录组数据进行KEGG分析的过程中，在map00190路径中发现，PPA基因所参与的代谢途径有明显差异。PPA基因发现于掌叶半夏，是一种植物凝集素基因，掌叶半夏凝集素具有凝血活性及与甘露糖及其聚合物专一结合的性质，有凝血、抗肿瘤、杀虫等重要的生理功能。1997年研究报道该蛋白对多种刺吸式口器害虫具有致死活性。本试验对通过基因本体功能分析发现，PPA基因对泛素蛋白转移酶活性有贡献，并参与SCF依赖性蛋白酶体泛素依赖蛋白分解过程。
玉米是主要的农作物，但源于玉米自身的抗虫基因报道较少。作为模式植物，SCHNABLE等于2009年发表了玉米B73参考基因组第一个版本，经不断完善，到目前为止已经更新至第四版（version 4）。本试验通过高通量测序技术利用Illumina Hiseq技术[15]对用黏虫处理的大刍草和玉米进行转录组测序，筛选出 DBT，HrpA，CYP86，cysK 和 PPA 5个抗虫候选基因。植物在响应昆虫取食为害时会产生次生物质、挥发物质和生物大分子物质，以减少伤害。本研究推测大刍草的抗虫性可能与类固醇生物合成，半胱氨酸和蛋氨酸的新陈代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的退化以及苯丙氨酸新陈代谢有关；并与抗虫基因编码的分子开关、抗虫代谢的关键蛋白以及次生代谢产物有关。同时，本研究为后续筛选参与抗虫代谢的基因提供了候选序列。
