Cu2+胁迫对生菜种子萌发和幼苗生理特性的影响

武玉珍，闫 芳

（晋中学院生物科学与技术学院，山西晋中030619）

随着城市建设和工业发展的快速推进，金属矿山被大量开采发掘，导致环境问题日益加重，重金属污染和监测得到了广泛关注，而铜污染是当前土壤、河流污染中较为突出的问题[1]。并且泥土、植物中的重金属离子，很难被微生物等降解，所以在泥土、植物内重金属离子得以积累，当积累到一定量时，就会威胁植物的生长，并且危及到人类健康，甚至影响整个生态系统的正常运转[2]。铜是高等植物生长、发育所必需的微量元素之一，它参与多种植物生理代谢过程，对植物的生长、发育等具有重要作用；但过多的铜对植物有毒害作用，会造成种子萌发过程中氧化还原作用失控，引起植物萌发障碍[3]。

生菜（Lactuca sativa）俗称叶用莴苣，或称鹅仔菜、莴仔菜等，属菊科莴苣属，是人们的日常生活中很好的一种绿叶蔬菜。田丹等[4]研究了重金属Cd2+对生菜种子萌发和幼苗抗氧化酶系统的影响，结果表明，在低浓度Cd2+作用下，生菜种子萌发受抑制不明显，在高浓度Cd2+作用下，生菜种子的发芽率、发芽势和发芽指数均呈下降趋势，同时较高浓度的Cd2+对生菜幼苗根和芽的生长情况、保护酶的活性也具有明显的抑制作用。程贯召[5]在2008年研究了Cu2+胁迫下小麦种子萌发和幼苗的生长状况，结果表明，Cu2+胁迫对小麦种子萌发的影响很大，随着Cu2+浓度的升高，小麦种子萌发率逐渐降低，且二者呈极显著负相关，高浓度抑制效应比较突出。黎建玲等[6]研究了在Cu2+作用下，南瓜种子萌发和幼苗生长状况，结果表明，在低浓度Cu2+作用下，与CK相比，南瓜种子萌发快，在高浓度的Cu2+作用下，与CK相比，南瓜种子萌发率明显下降。章家恩等[7]运用了2层滤纸和重复对照3次以及控制作用因子的方法，研究了在Ni2+，Cu2+的胁迫下，5种植物种子萌发、幼苗生长的状况，结果呈现出协同作用的趋势。但是，目前，Cu2+胁迫对生菜种子萌发和幼苗生长的影响还未见报道。

本研究通过水培试验，研究不同质量浓度Cu2+溶液对生菜种子萌发及幼苗生长的影响，旨在为生菜育种和种植过程中避免过量的Cu2+的伤害提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试生菜品种为大速生菜（Lactuca sativa），购自河北沧州科力丰种苗有限责任公司。

1.2 试验方法

选取年份相同、饱满度较好、完整且大小一致无霉变的大速生菜种子1 050粒。于实验室中用0.5%的次氯酸钠溶液浸泡30 min消毒，并用玻璃棒搅拌，然后用蒸馏水冲洗多次，用滤纸吸干水分，备用培养[8]。CuSO4溶液浓度梯度设置为 0（CK），5，10，20，50，80，120 mg/L。每个培养皿中放置 2 层滤纸，并在滤纸上放入生菜种子50粒，贴上标签备用（标签注明CuSO4溶液浓度及编号）。首次添加25mL培养液，定期向各处理培养皿中加入等体积的溶液，以保证各培养皿的水分条件和CuSO4溶液浓度恒定，设定周期温度、光照在恒温培养箱内进行周期培养[9-10]。

1.2.1 不同浓度CuSO4溶液对生菜种子萌发情况的影响 从第1天培养开始，每天15：00定时观察是否有小白尖状的芽伸出，并及时补充水分，记录测量并汇总各培养皿的出芽情况。

式中，Gt为生菜种子在t天内的发芽数，Dt为相对应发芽天数[11]。

1.2.2 不同浓度CuSO4溶液对生菜幼苗形态的影响 将刚发芽的大速生菜种子培育10 d后，对幼苗的株高、根长、可见叶片数进行观察测量。其中，从每组中各选45株生长良好的幼苗，用细线法测量株高，求平均值并记录；从每组中各选45条最长的根，用细线法测量根长，求平均值并记录；观察并记录可见叶片数。

1.2.3 不同浓度CuSO4溶液对生菜幼苗叶绿素含量的影响 当生菜幼苗长到4片叶子时，从每组分别选出具有代表性长势良好的叶片作为检测叶绿素含量的试验材料，共7组。

叶绿素含量的测定：把供试生菜幼苗叶片清洗干净，剪掉叶脉。称取叶片0.2 g，放入研钵中，加入少许石英砂和3 mL无水乙醇，研成均浆，加入乙醇10 mL，继续研磨，直至看到叶片组织颜色变白。静置3～5 min。剪取1张圆形滤纸，放入漏斗内并用乙醇润湿，将研钵中的液体倒入漏斗，用少量乙醇冲洗研钵、研棒和残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中；用滴管吸取乙醇，多次冲洗滤纸上的叶绿素，直至滤纸和残渣变为白色。用乙醇定容至100 mL，摇匀，静置备用。最后用分光光度计测量其在波长665，645 nm下的吸光度，以95%乙醇为空白对照调透光率为100%[12]。

式中，Ca为叶绿素a的质量浓度（mg/L）；Cb为叶绿素b的质量浓度（mg/L）；CT为总叶绿素的质量浓度（mg/L）。

式中，C为色素质量浓度（mg/L）；V为提取液总量（L）；N 为稀释倍数；W为叶片鲜质量（g）。

1.2.4 不同浓度CuSO4溶液对生菜幼苗SOD活性的影响（氮蓝四唑法） 称取0.6 g长势良好的生菜叶片，洗净、剪碎，置于研钵中（研钵提前预冷），滴入2 mL 0.05 mol/L的pH值为7.8的磷酸缓冲液，进行研磨，使叶片组织、细胞破碎，SOD充分溶解到缓冲液中，继续加缓冲液使最终体积为10 mL，然后取5mL用离心机于4℃，4000r/min离心15min，得到的提取液即为SOD粗酶液。然后取25 mL玻璃管2支，编号为1号、2号管，其中，1号为对照管，1号管滴入5 mL NBT溶液；2号管滴入5 mL NBT和100 μL粗酶液，混匀。将2个试管置于4 000 lx日光下，反应20 min（反应时，各管受光情况要一致，反应温度要控制在25～35℃）。反应结束后，以未光照的对照管为空白对照，测定1号、2号管的吸光度[13]。

式中，SOD为活性，以每g鲜质量酶单位表示；AS为样品管的吸光度；VT为样液总体积（mL）；VS为测定时，生菜叶片的用量（mL）；W为生菜叶片的鲜质量（g）；A0为未光照对照管的吸光度。

1.2.5 不同浓度CuSO4溶液对生菜幼苗POD活性的影响 称取生长良好的生菜幼苗叶片0.15 g，研成匀浆，在转速10 000 r/min离心15 min后，提取上清液，余下残渣二次提取，2次所得合并后即为粗酶液。加入0.05 mol/L的磷酸缓冲液2.9 mL，2%的 H2O21.0 mL，0.05 mol/L愈创木酚和 0.1 mL酶液。用加热煮沸5 min的酶液作对照，加入酶液后的反应体系，立即在34℃水浴中保温3 min，迅速稀释1倍，取2支玻璃比色皿，其中一支加入反应混合液3 mL和上清液1 mL，另一支为对照（加入不加酶的反应混合液）。利用分光光度计测量波长470 nm下的吸光值。用秒表每1 min读取一次数值，酶活性的含量多少用每分钟吸光值变化表示[14]。

式中，ΔA470为反应时间内吸光度的变化；Vt为粗酶液的总体积（mL）；W为生菜叶片鲜质量（g）；VS为测定时取用的酶液体积（mL）；t表示反应时间。

1.3 数据处理与分析

试验数据均为3次重复，采用Microsoft Excel 2010绘图并且对各个数据进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度CuSO4溶液对生菜种子萌发的影响

由图1可知，在同一发芽时间，随着Cu2+浓度的升高，生菜种子萌发量呈先升高后降低的变化趋势；与CK相比，5，10 mg/LCu2+胁迫对生菜种子萌发有促进作用，其中，10 mg/L Cu2+胁迫对生菜种子萌发的促进作用最明显，而 20，50，80，120 mg/LCu2+胁迫对生菜种子萌发均有抑制作用，其中，120 mg/L Cu2+胁迫对生菜种子萌发状况的影响极其显著。由此可见，在低浓度Cu2+作用下，生菜种子的萌发较快，在较高浓度Cu2+作用下，生菜种子的发芽率、发芽势和发芽指数均呈下降趋势。

2.2 不同浓度CuSO4溶液对生菜幼苗形态的影响

株高和根长是观察重金属对植物影响的重要表观特征。由图2可知，生菜幼苗株高与CK相比，分别减少 9，12，15，17，18，22 mm；生菜幼苗根长与CK 相比，分别减少 32，35，38，45，46，47 mm；在5，10 mg/LCu2+胁迫下，幼苗株高和根长与CK相差不大，当Cu2+质量浓度≥20 mg/L时，生菜幼苗株高和根长与CK差异极其显著，此时，生菜幼苗生长缓慢，从外形来看，胚轴呈卷曲状，生长形态异常，并且幼苗根部停留在胚根阶段，几乎无法生长、伸长，根尖部颜色从浅黄色逐渐加深，最终变成深褐色。随着Cu2+浓度的增大，生菜幼苗的可见叶片数逐渐减少，当Cu2+浓度≥20 mg/L时，部分叶片出现褐色斑点。由此可见，随着Cu2+浓度的增大，胁迫作用逐渐增强，且Cu2+胁迫对生菜幼苗根的毒害作用大于对幼苗的毒害作用。

2.3 不同浓度CuSO4溶液对生菜幼苗叶绿素含量的影响

从图3可以看出，与CK相比，低质量浓度的Cu2+（5～20 mg/L）促进生菜幼苗叶绿素的合成，高质量浓度的Cu2+（50～120 mg/L）会抑制叶绿素的合成。对于叶绿素b来说，只在Cu2+质量浓度为5 mg/L时含量稍有提高，其他浓度与空白相比无显著变化；而叶绿素a和总含量，同样在Cu2+质量浓度为5 mg/L时含量最高，在Cu2+质量浓度为50 mg/L时与空白相比差异显著，抑制了叶绿素的合成。

2.4 不同浓度CuSO4溶液对生菜幼苗SOD，POD活性的影响

由图4可知，当Cu2+质量浓度由0 mg/L升高到20 mg/L时，生菜幼苗中SOD活性逐渐升高；当Cu2+质量浓度达到50 mg/L时，SOD活性最高；随后，生菜幼苗中SOD活性逐渐下降。当Cu2+质量浓度由0 mg/L升高到20 mg/L时，生菜幼苗中POD活性差异不明显；当Cu2+质量浓度升高到50 mg/L时，POD活性最高；随后随着Cu2+浓度的升高，POD活性逐渐降低。

3 结论与讨论

种子萌发、幼苗生长是植物对外界胁迫比较敏感的时期，探究在胁迫的条件下植物种子萌发和幼苗生长的状况，从某方面来说，能反映出植物对胁迫的耐性和抗性，其可作为检测土壤重金属污染的指标[15-16]。本试验研究了不同浓度Cu2+对生菜种子萌发和幼苗生长的胁迫作用，证实了Cu2+对生菜种子萌发、幼苗生长具有显著影响，对萌发状况、株高、根长以及叶绿素、保护酶等生理生化指标有一定的影响。

闫晓明等[17]研究表明，当重金属离子浓度较低时，会促进植物种子萌发，当重金属离子浓度较高时，会抑制植物种子萌发。铜是植物生长发育的必需微量元素之一，但是过多的铜会导致植物体代谢紊乱，从而影响植物的生长发育[18-19]。随着Cu2+质量浓度的升高，生菜种子萌发参数呈现先升高后降低的变化趋势。其中，Cu2+质量浓度为10 mg/L时，生菜种子的萌发状况达到最大值，在农业生产中，可参考该浓度来催芽。本研究表明，随着Cu2+浓度的升高，生菜幼苗的叶绿素含量先升高后降低，这与王威等[20]、PENELOPE等[21]的研究结论相同。原因可能是由于过高浓度的Cu2+会破坏细胞结构，尤其是叶绿体结构，阻碍了叶绿素的合成；另一方面，Cu2+会加速叶片中原有的叶绿素的氧化分解，导致叶绿素含量下降。

研究表明，在重金属Cu作用下，使植物体内产生大量活性氧，导致氧化胁迫，而在植物体内，SOD是不可缺少的抗氧化酶，有清除活性氧、防止脂膜过氧化的作用[16]。植物可以通过自身的保护酶系统清除过多的活性氧，维持体内活性氧代谢平衡[8]。本研究结果表明，SOD，POD活性随着Cu2+浓度的升高均呈现先升高后略微降低的趋势，这与程贯召[5]的研究结果基本相同。在逆境胁迫下，SOD是避免细胞受到活性氧伤害的第一道防线，SOD活性增强是植物对Cu2+胁迫的应激反应。但是在高浓度Cu2+胁迫下，SOD活性略微下降，说明植物吸收大量Cu2+后，对SOD的合成有所影响。POD活性的增加说明，在Cu2+胁迫下，植物体内H2O2浓度增加，但随后有所下降，可能与植物吸收大量Cu2+后，影响了POD的合成有关。

本试验结果表明，低浓度的Cu2+对生菜种子萌发有一定的促进作用，高浓度的Cu2+抑制生菜种子的萌发；当Cu2+浓度≥10 mg/L时，生菜种子萌发参数呈降低趋势。因此，在农业生产生活中，可参考该浓度来催芽；同时生菜种子的萌发状况和幼苗长势还可作为土壤重金属污染程度的指标。

本试验选择了容易培养的绿色叶类蔬菜生菜作为试验材料，最终的结果能否代表所有蔬菜在不同浓度Cu2+胁迫下的生长状况，还需进一步研究。本试验只做了一次预试验，3次平行试验，受试验环境设备条件以及自身能力等方面的制约以及其他外在因素和实验误差的影响，所以，最终的试验结果能否代表不同浓度Cu2+胁迫下生菜种子萌发和幼苗生长的状况，还需进一步探究。