大蒜素对蜜蜂球囊菌的抑菌和杀菌活性研究

常志光，牛庆生，刘楠楠，宋延明，王志，徐凯，闫德斌

（吉林省养蜂科学研究所，吉林 吉林 132108）

蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）是蜜蜂白垩病的病原体，蜜蜂白垩病是侵染蜜蜂幼虫的一种传染病，染上白垩病的蜂群轻则群势减弱，重则全群覆没。我国蜜蜂白垩病发病率呈现稳定高发态势，是当前蜜蜂的主要病害之一。目前，人们对白垩病的防治主要以化学药品为主，由于化学药物极易在蜂产品中形成残留，从而影响了蜂产品的质量。

大蒜素（Allicin）别名大蒜新素、蒜辣素、二烯丙基二硫，是由大蒜（Allium Sativum L.）鳞茎原料提取的产品，是大蒜主要生物活性成分的总称，它具有不同程度的杀菌和抑菌作用，被誉为天然杀（抑）菌剂。大蒜素因其杀（抑）菌效果显著、无残留、无抗药性以及低成本等优点，被作为一种绿色多功能饲料添加剂广泛应用于家禽、家畜和水产养殖业[1～5]。饲喂大蒜素能提高动物的抗病能力并能减少抗生素的使用，在生产绿色无公害的动物性食品中发挥着重要的作用。

在养蜂生产中应用大蒜治疗白垩病已有报道[6～8]，为了进一步明确大蒜素对蜜蜂球囊菌的抑菌和杀菌作用，本试验采用蜜蜂球囊菌为受试菌，测试不同浓度大蒜素对蜜蜂球囊菌的体外抑菌和杀菌活性，为应用大蒜素预防和治疗蜜蜂白垩病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 药品 大蒜素（山东辰欣药业股份有限公司，含量99.6%，批号H20054020）。

1.1.2 菌株 蜜蜂球囊菌（A.apis） 由吉林省养蜂科学研究所综合实验室提供，已对菌种进行了形态、染色和生理生化反应等鉴定[9]。

1.1.3 主要仪器 电子分析天平（JD300，沈阳龙腾电子有限公司）；恒湿恒温培养箱（CTHI-250B，施都凯仪器设备上海有限公司）；冰箱（BCD-215KAGA，海尔集团）；高压灭菌锅（YX280B，上海三申医疗器械有限公司）；洁净工作台（SCB，北京东联哈尔仪器制造有限公司）。

1.1.4 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基的配制 马铃薯去皮切块100g，加入双蒸水500mL，煮沸20min，过滤，然后加入葡萄糖10g溶解，再分别加入琼脂10g、酵母膏 2g，用玻璃棒搅拌均匀。将青霉素（1.6 106IU）10g、链霉素（1.0 106IU）10g加入配制好的培养基中以抑制其它杂菌的生长。将培养基放入高压锅灭菌20min，灭菌后，在洁净工作台中把培养基倒入培养皿中备用。

1.2 抑菌试验

1.2.1 蜜蜂球囊菌悬液的制备 参照常规的虫生真菌的纯化方法，将纯化的菌种应用点植法移入PDA培养基上，待产生大量孢囊后，注入少量无菌水，置于10℃恒温箱15min，再置于25℃恒温箱30min，轻轻振荡，使孢子释放到水中，倒入装有玻璃珠的锥形瓶中，振荡并镜检，直到孢子球基本都分散为单个孢子时备用[10]。

1.2.2 蜜蜂球囊菌接种量的测量 用PDA培养基将大蒜素倍比稀释为1.5mg/mL、3.0mg/mL、6.0mg/mL、12.0mg/mL、24.0mg/mL、48.0mg/mL、96.0mg/mL的 7个浓度，移入平皿中备用；利用移液枪吸取蜜蜂球囊菌悬液置于试管内，用生理盐水以镜检计数方式配制成 l l07cfu/mL、l l06cfu/mL、l l05cfu/mL、l l04cfu/mL 4种浓度的菌悬液，分别接种于含不同大蒜素梯度的PDA培养基中。另用接种器将上述4种浓度的菌悬液接种于不含大蒜素的PDA培养基上，作为蜜蜂球囊菌生长的空白对照。然后，将试验组和对照组培养基均置于30℃ 80%湿度的恒温恒湿培养箱中培养，24h后观察菌株生长情况，测量不同菌浓度与大蒜素最小浓度的关系，以选取适当菌量。

1.2.3 琼脂稀释法测量最小抑菌浓度（MIC） 采用琼脂倍比稀释法测定大蒜素对蜜蜂球囊菌的MIC。用 PDA培养基将大蒜素倍比稀释为 96.0mg/mL、48.0mg/mL、24.0mg/mL、12.0mg/mL、6.0mg/mL、3.0mg/mL、1.5mg/mL7个浓度的药物梯度，用生理盐水将蜜蜂球囊菌以镜检计数方式配成l l05cfu/mL的菌悬液，应用接种器分别接种于含有不同药物梯度的PDA培养基中；另做不含药物的培养基接种菌悬液，作为生长菌的空白对照。试验组和对照组置于30℃80%的恒湿恒温培养箱中培养，72h后观察试验结果，测定菌株的MIC50和MIC90。参照陈晓月[11]的试验方法，并稍加改动，以无蜜蜂球囊菌生长、大蒜素浓度最低的PDA培养基组为大蒜素最小抑菌浓度（MIC）。1.2.4 琼脂培养基法测定最小杀菌浓度（MBC） 以倍比稀释法将大蒜素分别稀释为 48.0mg/mL、24.0mg/mL、12.0mg/mL、6.0mg/mL、3.0mg/mL、1.5mg/mL6个浓度，接种浓度为l l05cfu/mL的菌悬液；另制不含大蒜素的琼脂培养基，接种浓度为l l05cfu/mL的菌悬液作为空白对照。试验组和对照组置于30℃ 80%的恒湿恒温培养箱中进行培养，放置不同时间观察菌株的生长情况，测定菌株的MBC50和MBC90。

以上每个试验组做4个重复，最后取各组平均值进行分析。

2 结果与分析

2.1 接种菌量的确定

通过对蜜蜂球囊菌株浓度与最小抑菌浓度测定，在培养温度、湿度、时间相同的条件下，发现大蒜素的MIC与所接种的球囊菌浓度有关，由表1看出，在相同培养条件下大蒜素的最小抑菌浓度随球囊菌浓度的增加而不断提高，在球囊菌浓度范围为l l04cfu/mL～l l05cfu/mL之间为规则上升，在球囊菌浓度继续上升之后，大蒜素的MIC呈现不规则变化，为了获得较好的数值，并获得较一致的试验结果，本试验将球囊菌株接种浓度确定为l l05cfu/mL，用于进行抑菌和杀菌试验。

表1 大蒜素对不同浓度蜜蜂球囊菌的最小抑菌浓度影响Table 1 The effect of different concentrations of A.apis on the minimal inhibitory concentration of allicin

2.2 最小抑菌浓度的测定

大蒜素对球囊菌的MIC50为12.0mg/mL、大蒜素对球囊菌的MIC90为24.0mg/mL，表明大蒜素对球囊菌的MIC为12.0mg/mL。见表2。

表2 大蒜素最小抑菌浓度Table 2 The minimum inhibitory concentration of allicin

2.3 最小杀菌浓度的测定

以倍比稀释法将大蒜素稀释为 1.5mg/mL、3.0mg/mL、6.0mg/mL、12.0mg/mL、24.0mg/mL、48.0mg/mL6个浓度.分别测定大蒜素对蜜蜂球囊菌的最小杀菌浓度，结果表明，大蒜素对球囊菌的杀菌浓度为24mg/mL（表3）。该结果与抑菌试验的结果一致。

表3 大蒜素最小杀菌浓度Table 3 The minimum bactericidal concentration of allicin

2.4 不同浓度大蒜素对抑菌效果的影响

大蒜素对蜜蜂球囊菌有一定抑菌和杀菌作用，在应用12.0mg/mL的大蒜素时，球囊菌菌圈生长直径为13.5mm，菌落数≤50；在应用24.0mg/mL的大蒜素时，球囊菌菌圈生长直径为0mm，菌落数为0。数据表明，大蒜素对蜜蜂球囊菌的MIC为12.0mg/mL，MBC为24.0mg/mL，证明大蒜素对蜜蜂球囊菌具有较强的抑菌和杀菌作用。见表4。

表4 不同浓度大蒜素对抑菌效果的影响Table 4 The effect of different concentrations of allicin on bacteriostasis

3 讨论

大蒜是“地里长出来的抗生素”，因其能够抑制和杀灭多种菌，因此有“天然广谱抗生素”之称[12]，大蒜素是大蒜主要生物活性成分的总称，前人研究表明，大蒜素对变异链球菌、嗜水气单胞菌、结核分枝杆菌、气单胞菌等均能产生抑制作用[13～16]。

多年来，养蜂人常使用化学药物治疗蜜蜂白垩病，但化学药物的残留对蜂产品造成污染，严重影响蜂产品的质量。近年来，随着科学技术的发展以及人们对高品质蜂产品的追求，很多科研人员在尝试使用非化学药物或方法来治疗白垩病，如多功能生物制剂、中草药、天然植物提取液以及从蜂蜜中分离的一些芽孢杆菌等。

顾宗连[17]应用大蒜素水溶液喷洒巢脾，治疗蜜蜂白垩病获得意想不到的疗效。刘厚生[18]发现，应用拍碎的大蒜放置于巢框上防治蜜蜂白垩病非常有效。王长春[19]将大蒜捣碎成蒜泥加水定期在蜂箱内喷洒，可起到消毒、杀菌作用。

而关于大蒜素对蜜蜂球囊菌的抑菌、杀菌研究尚未见报道，本研究属于首次。在培养温度和培养时间相同时，大蒜素对蜜蜂球囊菌的MIC、MBC与接种细菌的浓度、培养时间相关，试验时应选择适当菌量。本试验先通过测定不同球囊菌浓度对大蒜素最小抑菌浓度的影响，选定受试菌的浓度为l l05cfu/mL，以期获得准确结果。试验结果表明：大蒜素对蜜蜂球囊菌的MIC为12.0mg/mL，MBC为24.0mg/mL，证实了大蒜素在体外对蜜蜂球囊菌具有较好的抑菌和杀菌作用。

大蒜素因其具有无抗耐药性、低残留、低成本等特点，是治疗蜜蜂球囊菌的良好绿色药物，既不会对蜜蜂造成毒害，又不会对蜂产品造成污染，用于治疗蜜蜂白垩病具有很好的应用前景。随着对大蒜素抗菌机理研究的深入，着力研究和开发适合蜜蜂的大蒜素药物，探讨将大蒜素添加到50%的糖浆中，配成大蒜素糖浆饲喂蜜蜂，达到治疗蜜蜂白垩病的目的。同时，研究探讨用脱臭大蒜素治疗蜜蜂白垩病，既能治疗蜜蜂疾病，又不会对蜂群繁育造成任何影响，这些都有待于进一步试验研究。