高良姜残渣黄酮的分离纯化及其抗氧化活性

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(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

高良姜(AlpiniaofficinarumHance),别名良姜、小良姜,是双子叶药姜科植物,主产于广东、广西、云南、海南、台湾等地,是一种热带多年生的山姜,属食药兼用的植物资源[1],具有温胃止吐、散寒止痛、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗腹泻等功效,可用于食品的调味剂、着色剂及抗氧化剂,医药方面还可用于治疗消化不良、反酸呕吐、胃溃疡等消化道系统疾病[2-4],具有较高商业价值。

高良姜中有效成分主要为挥发油、黄酮类及二芳基庚烷类化合物。目前对高良姜的开发利用主要集中在提取挥发油,其可作为镇痛止呕药使用,也可应用于食品、日化、农业等领域。然而高良姜中挥发油含量一般只有1%左右,提取挥发油后的残渣占到99%,且目前基本上没有加以利用,造成极大的资源浪费。高良姜残渣中含有丰富的黄酮类物质,具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、镇痛等作用[5-10]。国内已有通过大孔树脂和薄层层析法分离纯化高良姜总黄酮的研究,结果表明,经纯化后黄酮纯度能得到有效提升[11-12]。但相关研究仍相对匮乏,且未见对纯化前后的高良姜黄酮进行功能性测定的研究。

本研究以提取挥发油后的高良姜残渣为原料,提取其中的黄酮,并利用大孔树脂进行分离纯化,探讨其分离纯化条件,以期获得纯度较高、抗氧化活性较强的黄酮类化合物,为高良姜资源的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

高良姜 采自广东湛江徐闻县,经自然干燥成样品;芦丁标准品(纯度≥98%) 上海如吉生物科技有限公司;DPPH·标准品(纯度≥99%) 美国Sigma公司;大孔树脂AB-8、XAD-2、HPD-600、S-8、D-101 郑州华溢新技术有限公司;大孔树脂XDA-6、LSA-12、LX-213 西安蓝晓科技新材料股份有限公司;硫酸钠、无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、浓盐酸、邻苯三酚 分析纯,天津大茂化学试剂厂;三羟甲基氨基甲烷 分析纯,美国Sigma公司。

HWS24恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;LRH-150B恒温培养箱 广东泰宏君科学仪器股份有限公司;UV-5200紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;HY-5回旋式振荡器 常州澳华仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器有限公司;DW-HL828超低温冰箱 安徽中科美菱低温科技股份有限公司;Lab-1C-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 高良姜黄酮的提取 以高良姜为原料,粉碎并过20目筛,参考《中国药典》2015版第四部挥发油测定甲法并作适当修改[13],在料液比1∶12 g/mL、浸泡时间30 min的条件下提取挥发油,提取45 min后制得残渣。取一定量高良姜残渣,按料液比1∶40 g/mL加入57%(v/v)的乙醇,在82 ℃水浴下浸提3 h,将所得提取液经离心(5000 r/min,20 min)分离,取上清液于55 ℃、0.025 MPa下旋转蒸发浓缩至无醇味浸膏,用水稀释至适当浓度即为黄酮粗提液。

1.2.2 黄酮的测定 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[14],以芦丁为标准品绘制标准曲线,得到黄酮浓度与吸光度之间的回归方程:y=5.7611x+0.0561(R2=0.9995),按该方程计算黄酮含量。

1.2.3 树脂预处理 参考吴彩霞等[15]方法对大孔树脂进行预处理。

1.2.4 静态吸附与解吸

1.2.4.1 树脂的筛选 分别称取预处理后的大孔树脂HPD-600、S-8、XDA-6、LSA-12、LX-213、AB-8、D-101各1.000 g于锥形瓶中,加入50 mL浓度为1.5 mg/mL的黄酮粗提液并置于摇床中,恒温25 ℃振摇(180 r/min)24 h,测定上清液黄酮浓度;用滤网滤去粗提液后,用200 mL蒸馏水冲洗树脂并移入锥形瓶中,加入50 mL无水乙醇,于恒温25 ℃下振摇(180 r/min)解吸24 h,测定上清液中黄酮浓度。

参照以下公式计算吸附率(Q1)、解吸率(Q2)和黄酮得率(Q3)。

其中,C0、C1、C2分别为黄酮粗提液、吸附平衡后溶液和解吸平衡后解吸液的浓度(mg/mL);V1、V2分别为吸附后滤液和解吸液的体积(mL);m为大孔树脂质量(g)。

1.2.4.2 吸附与解吸动力学 按1.2.4.1的条件,对所筛选出的3种树脂进行静态吸附,每1 h测定一次上清液的黄酮浓度至吸附平衡,再用50 mL 70%的乙醇进行静态解吸,每10 min测定一次上清液的黄酮浓度至解吸平衡,计算树脂的吸附量和解吸量,绘制吸附和解吸动力学曲线。

1.2.4.3 洗脱液的筛选 取吸附饱和的XDA-6大孔树脂1 g于5个锥形瓶中,加入50 mL浓度分别为60%、70%、80%、90%、100%(v/v)乙醇,按1.2.4.1的条件进行静态解吸,取上清液测定解吸平衡时黄酮浓度,筛选最优的洗脱液。

1.2.5 动态吸附与解吸

1.2.5.1 上样流速对动态吸附的影响 采用湿法装柱将预处理好的XDA-6大孔树脂装入层析柱中,将浓度为2 mg/mL的黄酮粗提液分别按1、2、3 BV/h的流速上样,每10 mL收集一管,测定其黄酮浓度,绘制动态渗透曲线。

1.2.5.2 上样液浓度对动态吸附的影响 采用湿法装柱将预处理好的XDA-6大孔树脂装入层析柱中,将浓度分别为1、2、3 mg/mL的粗提液按2 BV/h的流速上样,每10 mL收集一管,测定其黄酮浓度,绘制动态渗透曲线。

1.2.5.3 洗脱液流速对动态解吸的影响 将粗提液按最优条件上样,以蒸馏水充分洗去杂质,用70%乙醇分别按0.5、1.5、2.5 mL/min的流速进行动态洗脱,每2 mL流出液收集一管,测定流出液的黄酮浓度,绘制洗脱曲线。

1.2.6 纯化效果评价

1.2.6.1 纯度的测定 将纯化前后的黄酮溶液于55 ℃、0.025 MPa下旋转蒸发浓缩至无醇味,然后置于-80 ℃中预冷24 h,在真空度为0.1 kPa,冷冻温度为-55 ℃,冷冻时间为24 h的条件下真空冷冻干燥成干粉样品,取等质量冻干样品用蒸馏水溶解并测定黄酮含量,按下式计算纯度:

式中,c为冻干样品溶液的黄酮浓度(mg/mL);v为定容体积(mL);m0为冻干样品质量(mg)。

1.2.6.2 DPPH自由基清除率的测定 将纯化前后的样品溶液稀释至等浓度,测定DPPH自由基清除能力[16],按以下公式计算清除率:

式中,A0为样品溶剂与DPPH-乙醇溶液混合液的吸光值;A为样品溶液与DPPH-乙醇溶液混合液的吸光值;B为样品溶液与无水乙醇混合液的吸光值。

1.2.6.3 超氧阴离子自由基清除率的测定 采用邻苯三酚自氧化法[17]测定纯化前后样品溶液的超氧阴离子自由基清除能力,按以下公式计算清除率:

式中,F0为Tris-HCl、样品溶剂与邻苯三酚-HCl溶液的吸光度增加速率;F为Tris-HCl、样液与邻苯三酚-HCl溶液的吸光度增加速率。

1.2.6.4 还原能力的测定 采用普鲁士蓝法[18]测定纯化前后样品溶液的还原能力,吸光值越高,还原能力越强。

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2016进行数据分析处理,Origin 9.0进行作图。

2 结果与分析

2.1 静态吸附与解吸

2.1.1 树脂筛选 通过静态吸附和解吸试验,7种大孔树脂的吸附率和解吸率测定结果如表1所示。

表1 7种大孔树脂的吸附和解吸性能Table 1 Capacities of absorption and desorption of 7 kinds of macroporous resins

由表1可知,吸附率大小排序为:XDA-6>LSA-12>AB-8>S-8>HPD-600>LX-213>D-101;解吸率从高到底的顺序为:D-101>LX-213>AB-8>XDA-6>LSA-12>HPD-600>S-8;黄酮得率从高到底的顺序为:AB-8>XDA-6>LX-213>LSA-12>D-101>HPD-600>S-8;综合考虑吸附率、解吸率及黄酮得率,其中AB-8、XDA-6和LX-213的黄酮得率都在75%以上且较为接近,因此,选用这3种树脂进行下一步的筛选。

2.1.2 吸附与解吸动力学 根据2.1.1结果筛选出的3种大孔树脂吸附和解吸动力学曲线分别如图1和图2所示。

图1 3种大孔树脂的吸附动力学曲线Fig.1 Absorption kinetics curve of 3 kinds of macroporous resins

图2 3种大孔树脂的解吸动力学曲线Fig.2 Desorption kinetics curve of 3 kinds of macroporous resins

从图1可以看出,3种树脂在前5 h的吸附量增加迅速,吸附速度较快,至8 h后基本达到平衡,此时,3种树脂的吸附量以XDA-6最大,其次是AB-8,LSA-12最小;从图2的解吸效果来看,XDA-6和LSA-12的解吸速度相对较快,10 min即可达到解吸平衡,且相同时间下XDA-6的解吸量高于LSA-12,而AB-8解吸速度相对较慢,需20 min才达到解吸平衡。综合考虑,XDA-6更适合于高良姜黄酮的分离纯化。

2.1.3 洗脱液筛选 不同浓度乙醇溶液的解吸结果如图3所示。

图3 乙醇浓度对解吸率的影响Fig.3 Effect of concentration of ethanol on desorption rate

由于乙醇浓度不同其极性强弱也有所不同,从而对黄酮的解吸产生影响,从图3可知,随乙醇浓度的升高解吸率呈先上升后下降的趋势,以70%乙醇的解吸率最高,达97.9%,当乙醇浓度大于70%时解吸率下降,说明70%乙醇极性适中,适合于高良姜黄酮的洗脱。

2.2 动态吸附与洗脱

2.2.1 上样流速对动态吸附的影响 不同上样流速的动态渗透曲线如图4所示。

图4 上样流速对动态吸附的影响Fig.4 Effects of sample flow rate on dynamic absorption

由图4可以看出,泄漏浓度会随上样流速的增加而上升,流速为1、2、3 BV/h时,达到泄漏点的流出液分别为31.6、31.6、21.0 BV,表明流速过快会使树脂吸附能力变差,降低黄酮利用率。因此,上样流速不宜过大,而较慢(1 BV/h)的流速使树脂达泄漏点的时间较长,树脂吸附效率较低,并且容易造成黄酮粗提取物在树脂柱上层析出和沉积,影响柱床的稳定从而影响纯化效果。综合考虑,选择2 BV/h为最适上样流速,此时,泄漏点的流出液体积为31.6 BV。

2.2.2 上样液浓度对动态吸附的影响 不同上样液浓度的动态渗透曲线,结果如图5所示。

图5 上样液浓度对动态吸附的影响Fig.5 Effects of flavonoid concentration of sample on dynamic absorption

由图5可知,上样浓度对黄酮的泄漏影响较大,上样浓度较高,为3 mg/mL时,黄酮泄漏较多,树脂过早达到泄漏点,且容易造成样品的浪费及柱床堵塞;而上样浓度较低,为1 mg/mL时,树脂的吸附效率较低。因此,上样液的浓度以2 mg/mL为宜,对应的泄漏点体积为31.6 BV。

2.2.3 洗脱液流速及用量对动态解吸的影响 不同洗脱液流速的洗脱曲线如图6所示。

图6 洗脱液流速对动态解吸的影响Fig.6 Effects of elution flow rate on dynamic desorption

由图6可以看出,1.5 mL/min和2.5 mL/min的流速洗脱效果较好,峰形对称,峰较高,而以0.5 mL/min的流速洗脱时,出峰较早,浓度峰不完整。综合考虑生产效率和经济性,选择洗脱流速为2.5 mL/min。当洗脱液用量达到3.1 BV时,流出液已基本不含黄酮,故洗脱液用量以3.1 BV为佳。

2.3 纯化效果评价

2.3.1 纯度测定 测定纯化前后黄酮的纯度发现,黄酮经分离纯化后,纯度由43.55%±0.15%提高到了85.42%±0.64%,纯度提升为原来的1.9倍,纯化效果理想,RSD值小于1.5%,说明实验精度高,效果显著。

2.3.2 DPPH自由基清除率的测定 纯化前后的高良姜残渣黄酮对DPPH自由基的清除效果如图7所示。

图7 DPPH自由基清除效果Fig.7 Results of DPPH free radicals scavenging

从图7可知,高良姜残渣黄酮对DPPH自由基清除能力随浓度增加而增强;相同浓度下,纯化后的黄酮对DPPH自由基的清除能力较强,清除率极显著高于纯化前的黄酮(p<0.05)。IC50由纯化前的0.014 mg/mL降低到纯化后的0.012 mg/mL。

2.3.3 超氧阴离子自由基清除率的测定 分别测定纯化前后的高良姜残渣黄酮对超氧阴离子自由基的清除效果,结果如图8所示。

图8 超氧阴离子自由基清除效果Fig.8 Results of superoxide anion free radicals scavenging

从图8可得,高良姜黄酮对超氧阴离子自由基清除能力随浓度增加而增强;在黄酮浓度为0.12～0.24 mg/mL的范围内,等浓度下纯化后黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力均比纯化前强,清除效果显著优于纯化前(p<0.05),其纯化前高良姜黄酮的IC50为0.222 mg/mL,经纯化后降低到了0.186 mg/mL。

2.3.4 还原能力的测定 纯化前后的高良姜残渣黄酮的还原能力结果如图9所示。

图9 还原能力测定Fig.9 Results of reducing ability test

从图9可以看出,纯化后黄酮的还原能力显著优于纯化前(p<0.05);在低浓度时,纯化前和纯化后的高良姜黄酮还原能力较为接近,但随浓度增加至0.2 mg/mL时,纯化后黄酮的还原能力大于纯化前的,且随浓度的上升,纯化后黄酮还原能力增长速度要比纯化前快,当浓度达到0.65 mg/mL时,纯化后黄酮的还原能力为2.55大于纯化前的1.97。可见,高良姜黄酮经纯化后的抗氧化活性增加。

3 结论

通过测定7种大孔树脂对高良姜黄酮的静态吸附和解吸能力,筛选出效果最优的大孔树脂为XDA-6,并进行动态吸附和解吸试验,优化出最佳分离纯化条件为:上样流速2 BV/h,上样液浓度2 mg/mL,上样量31.6BV,洗脱液为70%(v/v)乙醇,洗脱液流速2.5 mL/min,用量3.1BV,在此条件下,黄酮的纯度由43.55%±0.15%提高到了85.42%±0.64%;纯化后的黄酮具有更强的还原能力,对DPPH和超氧阴离子自由基清除率有所提高,IC50值分别由纯化前的0.014、0.222 mg/mL降低到纯化后的0.012、0.186 mg/mL,说明纯化有利于提高黄酮的抗氧化活性。