基于二维色谱及其联用技术筛查乳及乳制品中外源性风险物质的分析方法研究进展

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(1.陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021; 2.中国检验检疫科学研究院,北京 100123)

随着人们对食品安全问题关注度的增高与农业进出口贸易的增长,对于外源性风险物质监控的法规越来越严格。以农药残留为例,各国设置了不同的农药残留限量标准,这些严格的标准推动了更快速和更灵敏检测技术的发展。二维色谱具有峰容量大,分辨率、灵敏度和精确度高等特点,与质谱联用可对复杂样品中痕量成分的进行高通量筛查、多残留分析及精准定量。而乳制品中基质组分数量多,外源性风险物质多为痕量物质,含量极低,且各国标准中对于乳制品中风险物质的残留限量越来越严格,因此开展这方面的研究具有重要的意义。

根据图1和图2可知,近些年来,针对二维色谱的研究呈上升趋势,将其应用在乳及乳制品中外源性风险物质筛查分析方向前景良好。本文综述了近十年来二维色谱在乳及乳制品中风险物质筛查研究的应用进展,并对其发展趋势及相关应用前景进行了总结展望。

图1 Wed of Science数据库文献统计情况Fig.1 Web of Science database literature statistics

图2 中国知网数据库文献统计情况Fig.2 CNKI database literature statistics

1 乳与乳制品中外源性风险物质及其筛查分析技术简介

1.1 乳及乳制品中外源性风险物质概述

欧盟指令2002/657/EC对乳及乳制品中外源性风险物质定义为:在奶牛养殖与乳及乳制品生产、加工、流通过程中引入的物质。从养殖与加工引入的角度,将外源性风险物质分为:食品添加剂与非法添加物、农药残留、兽药残留、塑化剂和真菌毒素五大类。

1.1.1 食品添加剂与非法添加物 食品添加剂已经成为乳品工业技术进步和科技创新的重要推动力。GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》第2.1条对食品添加剂定义为:食品生产加工过程中为改善产品色、香、味等品质与为抗氧化、防腐、保鲜和加工工艺的需要加入食品中的天然或人工合成物质[1]。我国食品添加剂分为23个类别,其中在乳及乳制品中广泛应用的是乳化剂、增稠剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂这五种,以提高其理化性质与感官品质。依据GB 14880-2012《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》与11个增补公告,在乳制品中添加维生素、矿物质、核苷与核苷酸、不饱和脂肪酸等营养强化剂,起到平衡营养成分与弥补营养素缺失的作用[2]。

非法添加物指超出GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》与GB 14880-2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》(含5个增补公告)规定的使用范围,以及包括被列入全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治领导小组公布的五批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中的非法食用物质[3]。表1和表2所列为乳及乳制品中可能违法添加的非食用物质和可能滥用的食品添加剂名单[4]。

表1 乳及乳制品中可能违法添加的非食用物质名单Table 1 List of non-food substances that may be illegally added to milk and dairy products

表2 乳及乳制品中可能滥用的食品添加剂品种名单Table 2 Milk and dairy products may abuse the list of food additives varieties

1.1.2 农药残留 乳及乳制品中的农药残留主要来源于奶牛在饲养过程中,食用含有农药残留的饲料或饮用被污染的水源,经过食物链蓄积于人体;为抑制奶牛身上的细菌、真菌、线虫等以及周围蚊蝇等昆虫时,使用的杀虫剂、杀菌剂混入生乳中。乳及乳制品中农药残留对人体的危害为微剂量、长时期、慢性细微毒性效应[5]。主要国家和组织涉及乳及乳制品中农药最大限量443种,欧盟限定数量323种,占72.9%,其目的除了保护人体健康外,利用残留限量及其检测技术设置贸易障碍,作为国际贸易的技术壁垒[6]。我国GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》[7]中规定了在食品中433种农药的4140项残留限量,在乳及乳制品中设定了硫丹、艾氏剂、滴滴涕、狄氏剂、林丹、六六六、氯丹和七氯八项限量。

1.1.3 兽药残留 兽药残留是指动物产品任何可食用部分中所有与药物有关的物质残留,包括原药及其代谢产物。奶牛在喂养的过程中不合理使用β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类、苯并咪唑类、四环素类、磺胺类等治疗药物与饲料药物添加剂,饲养场周围土壤与水源污染,导致兽药残留在乳及乳制品中广泛存在[8]。兽药残留对人体健康的危害表现在细菌耐药性、肠道菌群失调症、过敏反应、变态反应、激素作用、以及致癌作用和致畸作用等方面[9]。除此之外,因具有抑菌作用,兽药残留还会影响发酵乳[10]、奶酪[11]等发酵型乳制品的加工工艺。日本规定兽药限量418种,欧盟和我国制定的兽药限量分别为390和45种[12]。

1.1.4 塑化剂 乳及乳制品中塑化剂主要来源于包装材料中塑化剂迁移,包材在生产、加工过程中通常需要添加塑化剂以增强塑料的柔韧性能[13]。塑化剂为脂溶性物质,而塑料本体结构与塑化剂间通过氢键和范德华力相连接,结合不紧密,所以乳及乳制品易被塑化剂污染[14]。最常用的塑化剂是邻苯二甲酸酯类化合物,包括邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)、邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)等。该类物质为“环境激素”,会引发心血管疾病,损害肝脏和泌尿系统,导致生殖功能紊乱、致畸、致癌并对机体的免疫功能造成影响[15]。

1.1.5 真菌毒素 奶牛食用被真菌毒素污染的饲料是导致鲜乳中含有真菌毒素的主要原因,其在乳及乳制品中的污染水平与毒素种类主要由喂养饲料被真菌毒素所污染程度决定。饲料储存或加工不当,如玉米在生长、收获及后期的贮存过程中发霉,产生黄曲霉毒素[16],奶牛食用被黄曲霉毒素、伏马毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素等真菌毒素污染的饲料后,在挤出的鲜乳中可检测到相应真菌毒素[17]。此外,除了伏马毒素B1,其余真菌毒素可经牛体代谢转化,例如脱氧雪腐镰刀菌烯醇转化为环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇,黄曲霉毒素B1转化为黄曲霉毒素M1,玉米赤霉烯酮转化α-玉米赤霉烯醇,T-2毒素转化为HT-2毒素,赭曲霉素A转化为赭曲霉素-α等多种代谢产物,因而,乳及乳制品中的真菌毒素包括饲料中原毒素及其毒性更高的代谢产物[18],其中黄曲霉毒素M1为二类致癌物,黄曲霉毒素B1为一类致癌物,可引起生长障碍、急性中毒、急性肝炎和肝细胞脂肪变性[19]。

表3 真菌毒素从饲料到牛奶的转移转化[20]Table 3 Mycotoxin transfer from feed to milk conversion[20]

1.2 筛查分析技术的定义

欧盟2002/657/EC将筛查分析技术定义为一种用于检测基质中关注的目标物质是否存在并予以定量的技术手段,该方法具有高通量与快速分析两个特点。筛查分析技术主要分为两类,第一类为已知目标化合物的筛查,即根据待分析目标化合物的性质与基质类型选择相应的前处理手段与检测仪器进行分析,这类确定对象的筛查分析技术与多组分化合物的检测技术不同之处为:其待分析化合物数目通常为200～500个,需要进行快速、高通量分析。第二类为未知目标物筛查技术,需要在海量的数据中筛选与确证,外源性风险物质与其性质的差异,决定了筛查分析技术所选用的仪器为高分辨率色谱或质谱,且需要运用化学计量学方法进行实验条件优化与数据处理。

2 二维色谱在乳及乳制品风险物质筛查方面的应用

复杂体系分离为食品分析的难点与热点,多维联用色谱技术为其提供了有力手段。使用传统的色谱分离方法,化合物色谱峰的重叠影响定性与定量结果准确度,而解决方法为提高色谱分离系统的峰容量[21],因色谱分辨率与色谱柱长度平方根成正比,分离时间与色谱柱长度成正比。同时,色谱峰的半峰宽随着升温速度减缓而增加,影响化合物检测限,所以通过提高柱选择性与柱效难以得到准确的分析结果,而最佳的解决方法为采用多维色谱技术[22-23]。多维色谱技术具有高峰容量、高灵敏度、瓦片效应和族分离、分离时间短等特点[24]。色谱与质谱联用技术因其选择性和特异性好、灵敏度高等特点而成为食品分析的常用方法。但低分辨质谱对于未知风险物质的鉴定有一定局限性,而离子阱质谱与飞行时间质谱等高分辨质谱可得到精确质量数,与二维色谱联用可为目标化合物乃至未知物的分析提供全面的数据,已成为风险物质筛查分析的先进方法。

全二维气相色谱(Comprehensive two-dimensional gas chromatograph,GC×GC)是将两根彼此独立且分离机理不同的色谱柱经过调制器连接而成的二维色谱系统。第一根色谱柱选用液膜较厚且较长的非极性柱,第二根色谱柱为液膜较薄且较短的手性柱或极性柱,两根色谱柱通过空毛细管连接。调制器为全二维气相色谱的核心系统单元,工作时冷气和热气周期性交替喷在毛细管柱上,第一根色谱柱流出的组分周期性的被捕集于冷喷点,对挥发性相近的组分聚焦,热喷将聚焦的组分脱附并径向脉冲式引入第二根色谱柱的柱头[25]。调制器将第一维色谱柱后流出组分切割为连续的切片(每个色谱峰分割为3～4个切片),每个切片再通过第二根色谱柱分离。检测器需要较小的内部体积,较短的响应时间和足够高的数据采集频率,以确保二级谱图的准确构建。经检测器分析后得到三维色谱图,x轴与y轴表示二维的保留时间,z轴为色谱峰响应强度[26]。其工作原理图如图3所示[27]。正交分离使二维色谱系统的最大峰容量近似等于两根色谱柱各峰容量乘积,被广泛应用于复杂样品基质分析。

图3 全二维气相色谱工作原理图Fig.3 Working principle diagram of GC×GC

二维液相色谱(Two-dimensional liquid chromatography,LC×LC)是将两个独立液相的分离技术系统应用于样品,被测样品通过柱结合技术进行柱间切换,从而完成在两根色谱柱之间的流动[28]。分析时,样品经第一维色谱柱分离、浓缩、捕集或切割后切换入第二维色谱柱中,其工作原理图如图4所示[29]。LC×LC分为离线和在线两种模式,离线模式是指第一维所流出的组分经收集后,依次进入第二维色谱柱中,可对每一维色谱柱的分离参数进行单独优化。在线模式是指第一维所流出目标组分直接被切入第二维,二维间的接口为核心装置[30]。而根据第一维流出的组分是否全部进入第二维色谱柱,可将二维液相色谱分为中心切割二维液相色谱和全二维液相色谱。二维液相色谱已经被广泛地应用在蛋白质表征,生物制药、天然产物研究及食品分析等方面。

图4 二维液相色谱工作原理图Fig.4 Working principle diagram of LC×LC

2.1 农药、兽药及环境持久性污染物分析

乳及乳制品基质复杂,药物及其代谢产物的检测过程涉及大量化合物。这些化合物的存在,使得乳及乳制品中药物及代谢产物的痕量分析甚至超痕量分析变得更为困难,所以选择高灵敏度、高分辨率以及高检测通量的分析仪器尤为重要[31]。Wang等[32]使用二维液相色谱质谱联用技术(LC×LC-MS)分析了乳制品中七类20种抗生素残留。实验采用基质固相分散体提取,用乙腈和水洗脱,旋转蒸发干燥,流动相定容后进行分析。奶粉和牛奶样品中各抗生素的检测限和定量限分别为0.10～2.40和0.33～7.92 μg/kg。人体摄入的持久性污染物(POPs)有95%来自于食品中,其中有些POPs是致癌物质,可能对胃、肾脏、脾脏、肝脏以及心血管、神经、循环、生殖、免疫和呼吸系统产生不利影响。目前食品中持久性污染物的分析已成为热点问题[33]。Douglas等[34]采用全二维气相色谱-飞行时间质谱(GC×GC-TOF-MS)对牛奶和奶油中34种农药异构体和代谢物进行了多残留分析。实验回收率为66%～84%,检出限均低于0.4 μg/kg。Korytár[35]采用GC×GC分析了牛奶中30种持久性污染物。实验RSD为1.5%～6.5%,获得满意的线性和重复性。David等[36]在MRM模式下,通过全二维气相色谱串联质谱法(GC×GC-MS/MS)分析奶粉中的七种多氯联苯(PCB)同系物。与GC-MS/MS对比,GC×GC-MS/MS需注射剂更少,且分析速度为GC分离的2倍。实验线性和重现性良好,可用于复杂食品基质和痕量PCB的检测。Jeremy[37]等以固相微萃取为前处理手段,对比气相色谱-四极杆质谱(GC-Quad/MS)和GC×GC-TOF-MS对牛奶中的苯和卤代化合物的分析结果。苯系化合物的数量从5个增加到66个,卤代化合物的数量从2个增加到22个,该实验表明GC×GC-TOF-MS的分析能力远远高于GC-Quad/MS,在共洗脱分析物和基质成分中分离毒性化合物的分析方面更具优势。Focant[33]等建立13C标记的同位素稀释GC×GC-TOF-MS法,用于检测牛奶、猪肉和鱼中17种二噁英(PCDD/Fs)和18种PCB。其中TOF-MS不太可能受到样品提取物质量影响,保证了分析方法的稳定性。该方法可在对污染物进行追溯查询时可准确确证PCB和PCDD/F同系物。

2.2 食品添加剂及非法添加物分析

食品添加剂是食品工业的重要组成部分,在改善食品的色、香、味,调整食品的营养结构、提高食品质量和延长保存期等方面,有着举足轻重的作用,被广泛地应用于各类食品中[38]。但国家标准与法规中规定在纯牛奶中禁止添加任何防腐剂、香精、着色剂、增稠剂等食品添加剂,因此对乳品中食品添加剂的筛查尤为重要。中心切割二维液相色谱因样品制备简单、样品损失少、回收率高且自动化程度高等特点,广泛应用于乳制品的质量控制分析。Hou等[39]建立了中心切割二维液相色谱法,用于同时定量分析酸奶五种添加剂。与单纯使用一维色谱分离相比,化合物回收率由75.1%～110.4%提高至94.5%～103.9%,表明全二维气相色谱法的检测限和线性动态范围明显优于传统的一维色谱方法。在随后研究中,Hou等[40]以牛奶和奶粉中麦芽酚、乙基麦芽酚、香草醛、乙基香兰素、苯甲酸、山梨酸和糖精钠为研究目标,Venusil XBP-C4色谱柱作为第一维柱,第二维采用Hypersil ODS-2 C18色谱柱,样品前处理采用稀释直接进样法,回收率为90.6%～105.4%,分析时间缩短且使用的溶剂更少。陈亮等[41]对牛奶中的糖精钠、苯甲酸、山梨酸、麦芽酚、乙基麦芽酚、乙基香草醛与香草醛等12种成分进行分析。样品仅需经过稀释、过滤两个预处理步骤便可进样测定。以Venusil XBP-C4柱作为第一维色谱柱,第二维分析柱采用Hypersil ODS-2 C18柱,12种待测物线性关系良好,日内、日间精密度较高,回收率范围为89.6%～105.4%,该方法可以很好的应用于测定乳及乳制品中的人工添加剂和香精成分。陈琦等[42]使用GC×GC-TOF-MS在20.5 min内可实现食品样品中19种防腐剂、抗氧化剂与13种非法添加物的快速分离与定性。对于乳制品样品,实验萃取溶液使用40 mL乙腈饱和的正己烷,加入8 g无水MgSO4脱水,以0.25 μm膜过滤,用乙腈稀释5倍进样。实验32种化合物检出限均低于0.5 mg/kg。

2.3 风味成分分析

牛奶中含有较多种类脂肪酸,是人体短链脂肪酸的重要来源,在加工过程中脂肪酸会发生一系列的自动氧化、分解、脱水、脱酸等反应,最终生成的2-戊酮,2-庚酮等化合物,具有较强的香气,是乳及乳制品主要香气来源[43]。Villegas等[44]将GC×GC与大气压电离质谱联用,建立了牛奶中顺式和反式十八碳脂肪酸的九种异构体筛查分析方法。Jaeho等[45]使用GC×GC和GC×GC-TOF-MS进行反油酸和异油酸两种反式脂肪酸的分离。实验日内重复性的RSD分别为≤9.56%和≤9.97%,日间重复性的RSD分别为≤8.49%和≤9.06%。实验发现异油酸与反油酸的比值可用来区分天然和氢化反式脂肪酸,评估乳制品的质量。周瑞泽等[46]使用GC×GC-MS建立了天然奶油和人造奶油中37种脂肪酸的检测方法,实现了37种脂肪酸的有效分离和准确测定。该方法定性准确,有助于根据脂肪酸种类及含量的不同进一步区分天然奶油和人造奶油,为奶油品质评价、掺假鉴别等食品安全保障工作提供有力的技术支撑。

Vlaeminck等[47]利用脂肪酸不饱和键排布的规律与不饱和程度,基于GC×GC建立了牛奶中非靶标脂肪酸高通量筛查分析方法,该方法奠定了乳品风味化学的研究基础。Stella等[48]将离子色谱与反相液相色谱联用(IC×RPLC)用于分析发酵乳、橙汁和葡萄酒中24种小分子有机酸,目标化合物在三维谱图中呈正交分布,检出限与定量限均满足分析需求。Cordero等[49]利用GC×GC-MS,基于动态顶空技术建立了全脂乳粉和脱脂乳粉中风味物质的比对方法,在获取两种乳粉指纹谱图的基础上结合主成分分析法,成功地确定了211种挥发物和半挥发物,从而确定了全脂乳粉和脱脂乳粉的风味化合物组成。Yue等[50]采用GC×GC-TOF-MS,运用固相微萃取技术作为前处理方式,对牛奶中的挥发性物质进行分析,不仅分离出了传统气相色谱-质谱联用可检测出的52种化合物,而且还鉴定出了在牛奶中未曾报道的107种化合物。GC-MS会造成组分共洗脱,不足以分离所有挥发性组分。而GC×GC-TOF-MS具有高峰容量,灵敏度和选择性,是定性和定量分析复杂基质样品的有效方法。在牛奶中挥发性物质的检测方向有良好前景。Ma等[51]建立了一种新的LC×LC方法,将从第一维色谱柱(C4)中洗脱的目标馏分储存在捕获柱(C8)上,通过六通切换阀将化合物切换入第二维色谱柱(C18),为了评估该方法的适用性,实验对市场销售的婴幼儿配方乳粉中的麦芽酚、乙基麦芽酚、香草醛和乙基香兰素进行了分析,其中在两个样品中分别检测到了香草醛和乙基香兰素。

3 结论

乳及乳制品基质复杂,传统的色谱技术由于其峰容量不足,分辨率较低等缺点,导致共流出物峰重叠现象严重,利用二维色谱技术分离分析乳及乳制品样品时,不仅能提高样品各组分的分离能力,而且在与质谱技术联用时,可以提高对样品各组分的定性与定量能力。目前,二维色谱技术的研究领域集中于二维分离体系中的接口技术研究[52]、与各种新型质谱技术进行有效联用[53]、利用新材料与新型离子化技术对复杂基质中多价态化合物进行高精确质量和高分辨率表征领域。复杂体系的分离为分析化学的难点与热点,多维联用色谱技术为复杂体系分离提供了有利手段,是实现食品中非靶标化合物筛查研究的主要突破点。