不同壳聚糖脱乙酰度测定方法的适宜性研究

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(1.西南科技大学,四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心,四川绵阳 621010; 2.绵阳师范学院,四川绵阳 621006)

壳聚糖是经甲壳素脱色、脱乙酰基后制备的天然生物大分子,是一种碱性、带有正电荷的由N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖组成的无分支二元多聚糖。由于其良好的安全性、成膜性、生物可降解性、生物相容性而被广泛用作功能食品、食品添加剂、果蔬保鲜剂、饮料澄清剂[1-2],医疗上可作药物载体、抗菌剂[3-4],同时可用于农业、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化等诸多领域[5-7]。壳聚糖脱乙酰度值的大小直接影响其粘度、溶解能力、离子交换能力、免疫活性、絮凝性能、膜的伸张性大小和氨基有关的化学反应能力等性质及开发应用[8]。因此,脱乙酰度是决定壳聚糖特定生理活性的重要参数之一,更是壳聚糖产品质量判定的一个主要指标。

现有的壳聚糖脱乙酰度测定方法较多,如红外光谱法、紫外光谱法、色谱法、线性电位滴定法、双突跃电位滴定法、酸碱滴定法、核磁共振法、库伦滴定法、元素分析法等,这些方法各有优劣,有的需要专门的仪器,所需成本高,但测定结果较准确,有的方法简单,操作方便,但测定精度较差[9-14]。同时,课题组研究发现，壳聚糖的来源、粘度、分子量等因素对测定方法的选择有较大影响,因此寻求一种简便快速、精密准确、成本低廉、通用性高的分析方法成为分析工作者研究壳聚糖脱乙酰度测定的目标。

本文首先比较了改良后的酸碱滴定法、线性电位滴定法、双突跃电位滴定法、胶体滴定法、紫外光谱法、红外光谱法六种常用测定方法,并对测定方法进行优化,继而采用不同来源与不同性质的壳聚糖考察优选方法的普适性,以期确定不同壳聚糖脱乙酰度测定方法的适用范围。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

壳聚糖(标示脱乙酰度:95.5%;分子量50000、100000;粘度76、60 mPa·s) 浙江金壳药业有限公司;高粘度壳聚糖(>400 mPa·s) Sigma公司;蜣螂、土元、蝉蜕 成都荷花池药材市场;浓盐酸、氢氧化钠、甲基橙、亚甲基蓝、甲苯胺蓝、高锰酸钾等试剂(均为分析纯)、溴化钾(优级纯)、聚乙烯硫酸钾溶液 和光纯药工业株式会社;N-乙酰-D-氨基葡萄糖 阿拉丁试剂。

HJ-4磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司;PHS-3E型pH计 上海精科雷磁仪器厂;FA1104电子天平 上海精科;Alpha-1500紫外可见分光光度计 上海谱元仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 改良酸碱滴定法 对于酸碱滴定法:精密称取标示脱乙酰度为95.5%的壳聚糖样品0.5 g,加0.1 mol/L HCl标准溶液30 mL,置磁力搅拌器上搅拌至完全溶解,加入2～3滴甲基橙指示剂,溶液变为红色,用0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定变成橙色,即为终点。实验显示,滴定终点不易判断,于是将甲基橙指示剂换为甲基橙-亚甲基蓝[15-16],则滴定时溶液由紫色变为淡绿色,便于观察,即为改良酸碱滴定法。记录消耗NaOH用量,用式(1)、式(2)计算脱乙酰度(DD)。

式(1)

式(2)

式中:C1,盐酸标准溶液的浓度(mol/L);C2,氢氧化钠标准溶液的浓度(mol/L);V1,加入的盐酸标准溶液的体积(mL);V2,滴定耗用的氢氧化钠标准溶液的体积(mL);G,样品重(g);W,样品的水分(%);0.016,与1 mL 1 mol/L的盐酸溶液相当的氨基量;9.94%,理论氨基含量。

1.2.2 双突跃电位滴定法 精密称取0.2 g干燥至恒重的标示脱乙酰度为95.5%的壳聚糖样品,置于50 mL烧杯中,加入20 mL 0.1 mol/L HCl标准溶液,室温下磁力搅拌使其完全溶解,再加入30 mL蒸馏水。将pH电极放入样品溶液中,用0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定,记录原pH及加入不同体积NaOH标准溶液后被滴定液的pH,以溶液的pH对NaOH标准溶液滴定体积作图,即得到酸碱滴定曲线,做pH对VNaOH的一级微商曲线,得到双突跃滴定曲线[17],按式(3)计算壳聚糖脱乙酰度。

式(3)

式中:n=C×(V2-V1);C,NaOH的浓度(mol/L);V1,第一突跃点时用去的NaOH标准溶液的体积(L);V2,第二突跃点时用去的NaOH标准溶液的体积(L);G,样品重(g)。

1.2.3 线性电位滴定法 精密称取标示脱乙酰度为95.5%的0.25 g壳聚糖,加入0.1 mol/L的HCl 20 mL,于磁力搅拌器上搅拌至壳聚糖完全溶解。加入10 mL蒸馏水,搅拌均匀,加入2～3滴甲基橙指示剂,搅拌均匀。用0.1 mol/L NaOH滴定,前2～4 mL NaOH滴加后,不记录pH,以后每滴加1 mL NaOH,搅拌均匀后,记录甲基橙指示剂变为黄色前的4个pH,将每个pH对应的氢氧化钠溶液的体积(v)代入函数式(4)。

式(4)

式中:f(v),电位滴定时,体积与电位的函数关系;V0,盐酸标准溶液的体积加上稀释用蒸馏水的体积(mL);V,氢氧化钠标准溶液的体积(mL);NB,氢氧化钠标准溶液的浓度(mol/L);[H+],H+的浓度(mol/L);[OH-],OH-的浓度(mol/L)。

计算f(v),以f(v)为纵坐标,V为横坐标作图,以直线外推与横坐标相交点的横坐标值为所用的氢氧化钠标准溶液的体积(Ve),按式(5)计算壳聚糖的脱乙酰度[18]。

式(5)

式中:C1,盐酸标准溶液的浓度(mol/L);C2,氢氧化钠标准溶液的浓度(mol/L);V1,加入的盐酸标准溶液的体积(mL);m,样品重(mg);161,壳聚糖中氨基葡萄糖的链节分子量。

表1 改良后的酸碱滴定法测定结果Table 1 Results of improved acid-base titration

式(6)

式中:NPVSK,PVSK的当量浓度(g/L);M壳,壳聚糖的链节分子量161.15;ΔV,消耗PVSK的体积差V1-V2(L);C,壳聚糖溶液的浓度(g/mL)。

1.2.5 紫外光谱法 以0.001 mol/L HCl为溶剂,用0.1 mg/mL N-乙酰葡萄糖胺配成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的标准溶液,以0.001 mol/L HCl为参比液,在203 nm处测定系列溶液的吸光度,绘制标准曲线。

称20 mg标示脱乙酰度为95.5%的壳聚糖样品于100 mL量瓶中,加入10 mL 0.01 mol/L盐酸溶解后,用去离子水稀释至刻度,摇匀,以0.01 mol/L盐酸作为参比液,测定其在203 nm处的吸光度,从工作曲线中得到样品中乙酰基的浓度[20],按式(7)计算脱乙酰度。

式(7)

式中:C乙酰基,样品中乙酰基的浓度(mg/mL);C样,壳聚糖样品浓度(mg/mL)。

式(8)

1.2.7 自制壳聚糖的制备 将蜣螂、土鳖虫、蝉蜕分别粉碎,取适量,加入1.3 mol/L HCl进行脱矿,继而加入4 mol/L NaOH溶液脱蛋白,收集残渣,去离子水洗至中性,50 ℃干燥12 h后先后加入3%高锰酸钾溶液与2%草酸溶液进行脱色,而后加入20 mol/L的NaOH溶液脱乙酰,50 ℃干燥12 h即得自制壳聚糖[22]。

1.2.8 通用性检测 通过比较上述几种脱乙酰度测定方法,筛选出准确度与精密度较高的方法,分别以高分子量(150000)、低分子量壳聚糖(50000)、高粘度(400 mPa·s)、中粘度(200 mPa·s)、低粘度壳聚糖(60 mPa·s)、自制壳聚糖为考察对象,进行通用性检测,从而考察不同测定方法对不同分子量、不同粘度、不同来源壳聚糖的适用性。

1.3 数据处理

每种方法做3次平行,结果取平均值±标准偏差,以样品标示脱乙酰度为真实值,精密度以相对标准偏差来衡量,准确度的计算如式(9)、式(10)、式(11)所示。

偏差=|脱乙酰度计算值-样品标示脱乙酰度|

式(9)

式(10)

式(11)

2 结果与分析

2.1 改良酸碱滴定法

由表2可知:市购壳聚糖的脱乙酰度为98.35%,相对标准偏差RSD为0.33%。以标示值为壳聚糖真实值,计算得准确度为97.01%。利用壳聚糖的自由氨基呈碱性,可与酸定量的发生质子化反应,形成壳聚糖的胶体溶液,以指示剂颜色变化为判定依据,确定滴定终点,得碱消耗量,使用甲基橙-亚甲基蓝指示剂进行滴定,改善了单用甲基橙作为指示剂的显色反应不明显的问题,提高了实验的可重复性。

2.2 双突跃电位滴定法

从图1、图2可知,用NaOH标准溶液滴定壳聚糖时,明显存在两个滴定突跃点,第一个突跃点范围在pH为2～4之间,第二个滴定突跃的范围在pH为6～8之间。前一突跃对应NaOH中和溶液中过量HCl的过程,后一突跃对应NaOH中和质子化胺基的过程,反映滴定终点前后的情况。计算得壳聚糖脱乙酰度为76.92%,相对标准偏差为0.28%,该结果与壳聚糖脱乙酰度标示值相差较大,准确度仅为80.55%,其原因可能是当样品溶液滴定至弱酸性时,壳聚糖沉淀逐渐析出,并粘附于玻璃电极的膜表面,导致溶液越来越浑浊与粘稠,从而严重干扰电极对溶液H+活度的响应,影响测定,同时延长了测定时间[23]。

图1 壳聚糖脱乙酰度的滴定曲线Fig.1 Titration curve of deacetylation degree of chitosan

图2 一级微商曲线Fig.2 First-order derivative curve

2.3 线性电位滴定法

由表2所得数据,以f(v)为纵坐标,滴定消耗NaOH溶液V(mL)为横坐标作图,如图3,回归方程为:y=-2.3168x+14.988,R2=0.9994,表明线性关系良好,以直线外推与横坐标相交点的横坐标值为所用的氢氧化钠标准溶液的体积,结果如表3所示。

表2 线性电位滴定法的V-f(V)Table 2 V-f(V)of linear potentiometric titration

表3 线性电位滴定法测定结果Table 3 Results of linear potentiometric titration

表4 胶体滴定法测定结果Table 4 Results of colloidal titration

图3 线性电位滴定法滴定曲线Fig.3 Linear potentiometric titration curve

计算得样品的脱乙酰度为87.35%,相对标准偏差为0.48%。由测定结果可知，线性电位滴定法准确度较高,重复性好,其原因是线性电位滴定法只需测定滴定终点前的4～5组数据,绘图外推即可得到滴定终点时所消耗的氢氧化钠用量,避免析出的壳聚糖干扰测定,影响滴定终点的判断,减少了因确定终点而引起的误差。

2.4 胶体滴定法

实验结果显示:壳聚糖脱乙酰度为84.15%,相对标准偏差RSD为2.36%。由结果可知，该方法的计算偏差较大,该方法易受到指示剂用量、溶液pH、滴定速度与离子强度等因素的影响[24],指示剂滴加过多,待测溶液变为深蓝色,当滴定至理论终点,溶液变色不明显,滴定终点判断滞后,造成测定偏差,滴定速度受氢离子电力速度限制,滴定过快,正负离子间来不及缔合,滴定的PVSK与指示剂作用变色,导致滴定终点判断提前,滴定过慢,溶液出现返色,均导致测定结果出现较大误差。

2.5 紫外光谱法

以等梯度浓度的N-乙酰-D-氨基葡萄糖溶液在203 nm处的吸光度(A)与浓度(mg/mL)绘制标准曲线,得回归方程为y=13.51x,R2=0.9975,表明线性关系良好。计算得到壳聚糖脱乙酰度为88.34%,相对标准偏差为0.66%,由表5可知测得的脱乙酰度值较真实值偏低,主要原因是D-氨基葡萄糖在203 nm处影响N-乙酰基-D-葡萄糖胺溶液吸光度的测定,使得吸光度偏大,样品中乙酰基浓度偏大,测得脱乙酰度偏低,另外,样品中含有的少量不溶性杂质也影响测定[24]。

表5 紫外光谱法测定结果Table 5 Results of UV spectroscopy

2.6 红外光谱法

样品的红外光谱如图4。

图4 壳聚糖红外光谱图Fig.4 Infrared spectrum of chitosan

计算得到样品的脱乙酰度为80.22%,与真实值相差较大,准确度为85.75%,相对标准偏差为1.86%,由于不同脱乙酰度,壳聚糖分子中酰胺基团参与形成的链内、链间氢键的数目均不同,酰胺峰的位置也将受到影响,且该方法对壳聚糖样品处理的要求较高,样品处理的好坏直接影响到测定结果,导致该方法可重复性低,操作难度大,技术要求高,需要特殊仪器。

2.7 六种方法的综合评价

从测定方法的准确度、精密度、简便性、耗时几方面对其进行综合评价,如表6所示。

表6 不同测定方法综合评价Table 6 Comprehensive evaluation of different measurement methods

结果显示:改良酸碱滴定法测定壳聚糖脱乙酰度,操作简单,不需特殊仪器,准确度与精密度高;双突跃滴定法取点多,接近终点时,析出的壳聚糖可影响pH及时准确的测定,滴定耗时长,操作繁琐,测定准确度较低;线性电位滴定法在滴定时取点少,较双突跃滴定方便省时;胶体滴定法对滴定速度控制严格,速度过快,不利于正负电荷的缔合反应,速度过慢,溶液有返色现象;红外光谱法、紫外光谱法均需要特殊仪器,其中红外光谱法操作步骤简单,但对实验人员的技能要求较高,而紫外光谱法测定脱乙酰度影响因素少,测定值客观准确,精密度较好,测定时所需样品量少,但测定对照用标准品价格较高。综上,改良酸碱滴定法、线性电位滴定法、紫外光谱法的测定准确度、精密度均较高。

2.8 通用性

针对不同来源、不同分子量、不同粘度的壳聚糖,对优选的改良酸碱滴定法、线性电位滴定法、紫外光谱法三种方法的通用性进行考察,结果如表7所示。

表7 不同壳聚糖脱乙酰度测定结果Table 7 Results of degree of deacetylation of different chitosan

由表7可知,上述三种方法通用性均较好,适用于大部分不同类型的壳聚糖。因低分子量(≤100000)的壳聚糖溶解后为黄色,滴加指示剂后溶液颜色受壳聚糖颜色影响,无法判定滴定终点,故无法采用酸碱滴定法及线性电位滴定法,应采用紫外光谱法,而高粘度(≥400 mPa·s)的壳聚糖脱乙酰度测定可采用线性电位滴定法,其余壳聚糖脱乙酰度测定均可使用改良后的酸碱滴定法,测定结果准确、精密度高,且所需仪器简单、成本低。

3 结论

红外光谱法对仪器和样品处理要求高,双突跃电位滴定法耗时长,胶体滴定法重现性差,且上述三种方法准确度较低,故非脱乙酰度测定的优选方法,而改良酸碱滴定法、线性电位滴定法、紫外光谱法的精密度与准确度均较高,且从通用性考察来看,改良酸碱滴定法、线性电位滴定法、紫外光谱法的通用性均较好,综合考虑,改良酸碱滴定法测定结果准确、精密度高,且所需仪器简单、成本低,是脱乙酰度测定的优选法,但该方法不能测定低分子量、高粘度壳聚糖,对于低分子量(≤100000)壳聚糖脱乙酰度的测定建议采用紫外光谱法,而高粘度(≥400 mPa·s)壳聚糖脱乙酰度的测定可采用线性电位滴定法。