基于荧光微球的免疫层析法快速检测黄曲霉毒素B1

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(1.无限极(中国)有限公司,广东江门 529156; 2.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047; 3.江西省兽药饲料监察所,江西南昌 330047)

黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)是黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)的次级代谢产物,以二呋喃环和香豆素为基本结构,具有强烈的致癌性和毒性,1993年被世界卫生组织的癌症研究机构划定为I类致癌物,其中黄曲霉毒素B1(AFB1)的致癌性和毒性最强,主要危害人和动物的肝脏[1]。目前,玉米、小麦等粮食作物中的AFB1的污染已受到广泛的关注[2],并已制定相应的国家限量标准[3-4]。同时决明子等药食同源的种子类作物受AFB1污染的情况也逐渐得到重视[5],很多国家制定了相应的限量标准。韩国决明子中AFB1最高限量为10 ng/g[6],意大利设定的最高限量则为5 ng/g[7]。因此,针对决明子中AFB1快速检测方法的建立具有前瞻性和必要性。

目前,传统的AFB1的检测方法主要有高效液相色谱法[8-9]和酶联免疫吸附法[10-11]等。这些方法的灵敏度高,重现性好,但样品的前处理比较复杂、耗时较长,需要专业人员操作和特定的仪器设备,不适合大批量样品的现场筛查。

免疫层析法是近年来迅速发展的一项快速检测技术,具有简便、高效、成本低、污染小等特点,非常适合于大批量样品的现场筛查[12]。免疫层析法有多种标记物可供选择,目前最常用的是胶体金纳米粒子(AuNP)[13]和荧光微球纳米粒子(Fitc@PS)[14]。胶体金纳米颗粒具有良好的稳定性,能够被长期保存,可以依靠肉眼对信号进行读取识别,达到可视化检测的目的[15]。但荧光微球比胶体金具有更高的信号值,更宽的线性范围,更好的批间重复性[16],适合于待检物的定量检测。

本研究以Fitc@PS制备免疫探针,旨在建立针对决明子中AFB1的定量免疫层析快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荧光微球(激发波长为470 nm,发射波长为525 nm,Fitc@PS) 美国Ocean Nanotech;AFB1检测抗原(AFB1-BSA)、AFB1单克隆抗体 本实验室制备;羊抗鼠二抗 艾美捷科技有限公司;AFB1标准品 北京索莱宝科技有限公司;脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品、赭曲霉毒素A标准品、T2毒素标准品、伏马毒素B1标准品、玉米赤霉烯酮标准品、牛血清白蛋白(BSA)和乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC) 美国Sigma公司;其它试剂 均为分析纯。

BG-12 C超声仪 广州邦洁电子产品有限公司;HGS510划膜喷金机、HGS-201可编程切条机和荧光微球试纸条读取仪 杭州峰航科学仪器有限公司;TGL-16型高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;硝酸纤维膜(NC膜) 德国Sartorius公司;聚酯膜(滤纸)、样本垫、结合垫、吸水纸和PVC底板 上海金标生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Fitc@PS免疫探针及免疫层析试纸条的制备 用0.2 mol/L的Na2CO3溶液或1 mol/L的HCl溶液调节0.7 mL PB缓冲液(0.01 mol/L)pH至一定值,加入12 μL荧光微球(0.12 mg),混匀超声2 min(600 W,40 kHz)后分别加入100 μL EDC(0.05 mg/mL)和一定浓度的100 μL AFB1单克隆抗体溶液,室温反应30 min 后再加入100 μL EDC(0.05 mg/mL),继续室温反应30 min,加入111 μL 10%(w/v)BSA溶液及100 μL EDC(0.1 mg/mL),封闭120 min。4 ℃、13500 r/min离心15 min,弃上清,以200 μL复溶液(0.01 mol/L PBS、5%蔗糖、2%果糖、1% PEG-20000、1% BSA、0.4% Tween-20)重悬沉淀[17]。

用HGS510划膜喷金机在NC膜上喷涂一定浓度的AFB1-BSA(0.74 μL/cm)和羊抗鼠二抗(0.9 mg/mL,0.74 μL/cm),分别作为检测线(T线)和质控线(C线),在结合垫上喷涂Fitc@PS免疫探针。将滤纸、样本垫、结合垫、NC膜、吸水纸按顺序贴于PVC底板上,切成3.9 mm宽的试纸条。制备好的试纸条置于密封袋中,干燥阴凉条件下保存。

1.2.2 Fitc@PS及Fitc@PS-mAb复合物的表征 通过扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)对Fitc@PS进行表征。通过粒度仪对Fitc@PS及Fitc@PS-mAb复合物进行动态光散射(Dynamic light scattering,DLS)分析,表征AFB1抗体是否成功标记于Fitc@PS上。

1.2.3 抑制率的测定 采用荧光微球试纸条读取仪分别读取荧光微球试纸条上T线和C线的荧光信号值,计算抑制率。抑制率=1-BX/B0,BX为阳性样本T线和C线信号强度的比值,B0为阴性样本T线和C线信号强度的比值。

1.2.4 荧光微球试纸条的单因素实验

1.2.4.1 标记pH的选择 将PB缓冲液的pH分别调整为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,在此条件下将Fitc@PS与60 μg/mg的AFB1单克隆抗体进行偶联,制备Fitc@PS免疫探针。通过荧光微球试纸条(T线上AFB1-BSA的浓度为0.8 mg/mL)读取仪读取T线和C线的荧光信号值,根据抑制率,比较五个不同标记pH下,Fitc@PS与AFB1单克隆抗体的偶联结果。

1.2.4.2 抗体标记量的选择 在最佳标记pH下,分别选取30、40、50、60和70 μg/mg五个抗体标记量进行Fitc@PS免疫探针的制备。比较不同抗体标记量下,检测线(T线)信号强度和质控线(C线)信号强度的比值(T/C值)和抑制率的结果。

1.2.4.3 AFB1-BSA浓度的选择 在最佳标记pH以及最佳抗体标记量下,分别将0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的AFB1-BSA喷在NC膜上作为检测抗原。比较不同AFB1-BSA浓度下,T/C值和抑制率的结果。

1.2.5 免疫层析试纸条的检测步骤 将决明子样本粉碎,过18目筛,准确称取1 g,用纯甲醇进行提取,振荡3 min,4 ℃、4000 r/min离心10 min,取上清,用0.01 mol/L PBS溶液(pH7.4)稀释到甲醇终浓度为20%,取100 μL试样滴加于试纸条样本垫上。

如图1所示,反应20 min 后,荧光微球免疫层析试纸条经荧光微球试纸条读取仪读取T/C值,通过所建立的标准曲线来进行定量检测。

图1 黄曲霉毒素B1免疫层析试纸条检测原理图 Fig.1 Schematic diagram of lateral flow strip for the detection of AFB1

1.2.6 荧光微球免疫层析试纸条的评价

1.2.6.1 灵敏度评价 以AFB1浓度为X轴,BX/B0为Y轴绘制荧光免疫层析方法标准曲线。在经UPLC确证为阴性样本的决明子提取液(提取方法同1.2.5)中加标:0、0.01、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 ng/mL,每个浓度梯度进行三组平行实验,灵敏度通过阴性样本的平均值减三倍的标准偏差计算[18]。

1.2.6.2 特异性评价 PBS缓冲液中分别加入黄曲霉毒素B1(AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、赭曲霉毒素A(OTA)、T2毒素、伏马毒素B1(FB1)和玉米赤霉烯酮(ZEN),配制标准品溶液,其中AFB1标准品溶液浓度为1 ng/mL,其它标准品溶液浓度均为100 ng/mL。用本实验所建立的免疫层析检测方法进行检测,每个条件重复三次。

1.2.6.3 准确度验证 参照本方法的线性范围,阴性决明子样本加标0、1、2.5、5、10 ng/g后,用本实验所建立的免疫层析方法进行检测,并将结果与UPLC方法的检测结果进行比较,评价本实验所建立检测方法的准确度。

2 结果与分析

2.1 Fitc@PS及Fitc@PS-mAb复合物表征

扫描电镜图像显示Fitc@PS粒径均一,分散均匀,平均直径为340 nm(图2)。Fitc@PS-mAb复合物中的抗体是通过氨基与Fitc@PS微球表面经EDC活化的羧基作用实现偶联的。动态光散射结果显示(图3),Fitc@PS的平均水化粒径为302 nm,而标记抗体后平均水化粒径增大至324 nm,表明AFB1单克隆抗体成功与Fitc@PS偶联。

图2 Fitc@PS扫描电镜图像Fig.2 SEM images of Fitc@PS

图3 Fitc@PS及Fitc@PS-mAb复合物的动态光散射分析Fig.3 DLS analysis of Fitc@PS and Fitc@PS-mAb complex

2.2 免疫层析试纸条的优化

2.2.1 标记pH的优化 在不同的pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)下,抗体的活性及抗体与标记物的结合效率不同[19]。如图4A,在Fitc@PS标记抗体中,不同pH下,阴性T线荧光信号值差异显著(p<0.05)。当pH为7时,T线阴性信号值最大,因此最佳pH为7。

2.2.2 抗体标记量的优化 在最佳标记pH下,研究了抗体标记量对免疫层析的影响。如图4B,在Fitc@PS免疫层析系统中,不同抗体标记量下,阴性T/C值差异显著(p<0.05)。当抗体标记量为60 μg/mg时,阴性T/C最大,因此最佳抗体标记量为60 μg/mg。

2.2.3 AFB1-BSA浓度的优化 如图4C,在Fitc@PS免疫层析系统中,在不同AFB1-BSA浓度下,阴性T/C值在四个水平的AFB1-BSA浓度间(0.6、0.8、1.0和1.2 mg/mL)差异显著(p<0.05)。当AFB1-BSA浓度为0.8 mg/mL时有合适的T/C值(T/C值为1.78,T/C值过高会导致高的CV值,T/C值过低会导致线性范围变窄),因此最佳检测抗原浓度为0.8 mg/mL。

图4 荧光微球免疫层析试纸条的单因素实验Fig.4 Single factor experiment of fluorescent microsphere lateral flow strip注:图中不同小写字母表示在p<0.05水平上差异显著。

2.3 免疫层析试纸条的评价

2.3.1 灵敏度评价 标准曲线如图5所示,通过线性拟合得到标准曲线及相应的线性范围,a为低浓度曲线,线性范围为0.1～0.6 ng/mL,线性方程为y=-0.5854 log(x)+0.09948,R2=0.9846;b为高浓度曲线,线性范围为0.6～2.0 ng/mL,线性方程为y= -0.2234 log(x)+0.1654,R2=0.9888。其中,x为溶液中的AFB1浓度,y为BX/B0值,灵敏度为0.034 ng/mL。

图5 AFB1荧光微球免疫层析试纸条标准曲线Fig.5 Calibration curve of the fluorescence microsphere lateral flow strip to quantitatively detect AFB1注：a:低浓度标曲;b:高浓度标曲。

2.3.2 特异性评价 特异性结果显示，Fitc@PS免疫层析试纸条有很好的特异性。如图6,只有在AFB1的加标检测中产生了明显的抑制。其中,BX为加标样本T线和C线的信号强度比值,B0为阴性缓冲液T线和C线的信号强度比值。

图6 免疫层析试纸条特异性Fig.6 Specificity of the lateral flow strip注：a:阴性;b:黄曲霉毒素B1;c:脱氧雪腐镰刀菌烯醇;d:赭曲霉毒素A;e:T2毒素;f:伏马毒素B1;g:玉米赤霉烯酮。

2.3.3 准确度评价 将荧光微球免疫层析法对加标决明子样本的检测结果与UPLC的检测结果绘制线性相关曲线,结果显示，两种方法检测结果的相关性很好(图7),R2为0.9963。因此本文所建立的荧光微球免疫层析法检测结果准确可靠。

图7 荧光微球免疫层析试纸条与UPLC检测决明子中AFB1结果相关性Fig.7 Correlation of AFB1 assay between the fluorescence microsphere lateral flow strip and UPLC method in Semen cassiae samples

3 结论

本研究以Fitc@PS为标记物,成功建立了针对决明子基质中AFB1的荧光微球免疫层析试纸条定量检测方法。方法灵敏度为0.034 ng/mL,具有良好的特异性,且与UPLC的检测结果一致,可以满足现场大批量决明子样本中AFB1快速、准确和定量检测的需求。