超声波辅助法提取假苹婆树叶总黄酮及其清除羟自由基能力

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(1.广西民族师范学院化学化工学院,广西崇左 532200; 2.广西高校桂西南特色植物资源化学重点实验室培育基地,广西崇左 532200)

假苹婆(SterculialanoeolataCav.)为梧桐科植物,又称为赛苹婆、鸡冠木,在我国的广西、广东和云南等地均有种植,是西南地区的特色树种之一。假苹婆的适应性强,可作为城市郊区生态风景林的混交树种,也可作为风景树和绿荫树[1],其根和叶可舒筋活络,祛风活血,种子可以食用和榨油,全株具有清热解毒,消肿止痛的功效。主治瘀血疼痛、青紫、肿胀、跌打损伤等症[2]。黄酮类化合物不但具有抗氧化性,还具有抗肿瘤、抗菌和抗病毒活性[3-5]。提取黄酮类化合物的方法有超声波辅助提取法、溶剂浸提法、微波辅助提取法、加压流体提取法、超临界CO2流体提取法等[6-8]。超声波辅助提取法具有操作简单,提取时间短,成本低等优点,已经应用于天然产物的提取研究[9-10]。

目前,有研究者对藜麦种子[11]、费菜[12]和香椿叶[13]等植物中的黄酮类化合物进行了提取和分离,而由于假苹婆种植区域局限,对其树叶中黄酮类化合物提取工艺及抗氧化活性的研究鲜有报道。本文以假苹婆树叶为原料,通过超声波辅助提取假苹婆树叶中的黄酮类化合物,并对其抗氧化活性进行了研究,以期为更全面地开发利用假苹婆提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

假苹婆树叶(树龄:约20年) 2015年8月采摘于广西民族师范学院;芦丁标准品(生化试剂) 上海晶纯试剂有限公司;氢氧化钠(分析纯) 广东光华科技股份有限公司;95%乙醇、30%过氧化氢、抗坏血酸、亚硝酸钠、硝酸铝、水杨酸、七水合硫酸亚铁等 均为分析纯。

7200型可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;JA1003N电子天平 上海精密科学仪器有限公司;SG2200HPT型超声波洗涤机 上海冠特超声仪器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 总黄酮提取工艺 将采摘后的假苹婆树叶洗净,55 ℃下干燥24 h,利用中药粉碎机粉碎,过60目筛,用石油醚以1∶25 (w/v)的比例浸泡,连续强力搅拌去除叶绿素,再在50 ℃下干燥8 h后得到假苹婆树叶粉末,常温下避光保存备用。取1.0000 g假苹婆树叶粉末,按照一定的料液比加入一定体积分数的乙醇溶液,在一定的提取温度下,按照一定的提取功率提取一定的时间。反应结束后,过滤,将滤液定容至100 mL,摇匀备用。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响 固定料液比1∶25 (g/mL)、提取温度50 ℃、提取时间35 min、提取功率60 W,采用1.2.1方法提取假苹婆树叶粉末总黄酮并考察不同乙醇体积分数30%、40%、50%、60%、70%对总黄酮得率的影响。

1.2.2.2 提取功率对总黄酮得率的影响 固定乙醇体积分数50%、料液比1∶25 (g/mL)、提取温度50 ℃、提取时间35 min,采用1.2.1方法提取假苹婆树叶粉末总黄酮并考察不同提取功率50、60、70、80、90 W对总黄酮得率的影响。

1.2.2.3 提取时间对总黄酮得率的影响 固定乙醇体积分数50%、提取功率60 W、料液比1∶25 (g/mL)、提取温度50 ℃,采用1.2.1方法提取假苹婆树叶粉末总黄酮并考察不同提取时间25、35、45、55、65 min对总黄酮得率的影响。

1.2.2.4 提取温度对总黄酮得率的影响 固定乙醇体积分数50%、提取功率60 W、提取时间55 min、料液比1∶25 (g/mL),采用1.2.1方法提取假苹婆树叶粉末总黄酮并考察不同提取温度40、50、60、70、80 ℃对总黄酮得率的影响。

1.2.2.5 料液比对总黄酮得率的影响 固定乙醇体积分数50%、提取功率60 W、提取时间55 min、提取温度70 ℃,采用1.2.1方法提取假苹婆树叶粉末总黄酮并考察不同料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g/mL)对总黄酮得率的影响。

1.2.3 正交试验设计 在单因素实验基础上,选取乙醇体积分数、提取功率、提取时间、料液比四个因素,设计四因素三水平L9(34)正交试验,以确定较优假苹婆总黄酮提取工艺,因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 总黄酮得率的测定 参考文献[14]的方法,用60%(体积分数,下同)的乙醇溶液配制50 mL 0.3 mg/mL的芦丁标准溶液,准确吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL芦丁标准溶液分别加入到10 mL比色管中,对应加入0.4 mL 5%的NaNO2溶液,摇匀后放置6 min,再加0.4 mL 10%的Al(NO3)3溶液,摇匀后放置6 min,加入4.0 mL 4%的NaOH溶液,然后用60%的乙醇溶液定容,摇匀,静置15 min。于510 nm处测定各溶液吸光度,以芦丁质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得曲线方程为:y=44.638x+0.0028,R2=0.9994。按照芦丁标准曲线的测定方法测定样品液的吸光度,再由式(1)计算总黄酮得率。

式(1)

式中,C为根据芦丁标准曲线计算出来的提取液质量浓度(mg/mL);V为样品定容体积(mL);N为稀释倍数;M为假苹婆树叶干粉质量(mg)。

1.2.5 假苹婆总黄酮清除羟自由基的活性测定 在比色管中加入0.5 mL 9.0 mmol/L水杨酸-乙醇溶液,再加入不同体积总黄酮提取液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5,0.5 mL 9.0 mmol/L Fe2+溶液,3.5 mL蒸馏水,再加入5.0 mL 88 mmol/L的H2O2溶液,摇匀后放置15 min,在510 nm处测定吸光度,记为A1;用0.5 mL蒸馏水代替Fe2+溶液,测得的吸光度记为A2;取0.5 mL蒸馏水代替总黄酮提取液测得的吸光度记为A3。各吸光度均平行测定三次,按式(2)计算羟自由基清除率P,最后取平均值。同时均以抗坏血酸作阳性对照。

式(2)

1.3 数据处理

采用Microsoft Excle(Office 2010)、Origin8.5软件进行数据处理及分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇体积分数对假苹婆树叶总黄酮得率的影响 从图1可以看出,当乙醇体积分数低于40%时,总黄酮得率较低,这是由于乙醇体积分数较小,水含量相对多,有较多水溶性成分溶出,使得总黄酮得率较低。当乙醇体积分数为50%时,总黄酮得率达到最大,说明假苹婆树叶中中等极性的黄酮类化合物含量较高。继续增大乙醇体积分数,总黄酮得率减小,说明乙醇体积分数较大时,溶剂的极性降低,大量的脂溶性和醇溶性成分溶出,使黄酮类化合物溶解度降低,从而导致总黄酮得率减小[15]。因此,提取假苹婆树叶总黄酮的乙醇体积分数以50%为宜。

图1 乙醇体积分数对假苹婆总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on yield of the total flavonoids from the Sterculia lanceolata

2.1.2 提取功率对假苹婆树叶总黄酮得率的影响 由图2所知,当超声波功率为50 W时,总黄酮得率较低,这是由于功率较低,不足以使物料充分受到超声波的作用。功率为60 W时,总黄酮得率最大,继续增大提取功率,总黄酮得率降低,这是因为超声波功率较大时,对黄酮类化合物具有破坏作用,故选取60 W为较佳提取功率。

图2 提取功率对假苹婆总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of power on yield of the total flavonoids from the Sterculia lanceolata

2.1.3 提取时间对假苹婆树叶总黄酮得率的影响 由图3可知,提取时间为25～55 min时,总黄酮得率随着时间的延长逐渐增大,其中,提取55 min总黄酮得率最大,继续延长提取时间,总黄酮得率急剧减小。这是因为:一方面,提取时间较短时,假苹婆中的黄酮类化合物没有完全溶出,使得总黄酮得率低,55 min时,黄酮类化合物已基本溶出,再延长时间,提取出来的黄酮类化合物结构受到破坏,导致最后的提取率减小;另一方面,由Fick定律可知,提取率和时间具有正相关关系,但提取时间过长,扩散系数降低,影响总黄酮得率,且杂质的溶出量也会随着提取时间的延长而增加,不利于后续分离纯化[16-17]。综合考虑得率和能耗,选取55 min为较佳提取时间。

图3 提取时间对假苹婆总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of time on yield of the total flavonoids from the Sterculia lanceolata

2.1.4 提取温度对假苹婆树叶总黄酮得率的影响 由图4可知,当提取温度低于60 ℃时,总黄酮得率较低,温度高于60 ℃时,总黄酮得率快速增大,70 ℃时达到最大。这是因为温度升高之后,黄酮类化合物的渗透、扩散和溶解速度也进一步加快,有利于其溶出[18]。再升高温度,得率有减小趋势,这是因为在高温下,热稳定性差的黄酮成分会发生降解,造成总黄酮得率减小,故选取70 ℃为适宜提取温度。

图4 提取温度对假苹婆总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of temperature on yield of the total flavonoids from the Sterculia lanceolata

2.1.5 料液比对假苹婆树叶总黄酮得率的影响 由图5可知,料液比在1∶15～1∶25 (g/mL)之间时,假苹婆总黄酮得率随料液比的增大而缓慢增大,但整体得率相对较小,这是因为溶剂量过少,体系中溶出的黄酮类化合物与未溶出的黄酮类化合物浓度很快接近平衡,使总黄酮不能完全溶出。当料液比从1∶25 (g/mL)增加到1∶30 (g/mL)时,总黄酮得率明显增大,继续增加溶剂用量,总黄酮得率减小,考虑到溶剂量过多会增加下一步的浓缩时间,而且造成原料浪费,故选取1∶30 (g/mL)为适宜料液比。

图5 料液比对假苹婆总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of ratio of raw material and liquid on yield of the total flavonoids from the Sterculia lanceolata

2.2 正交试验

根据单因素实验结果,选择乙醇体积分数、提取功率、提取时间、料液比4个因素按照表1设计L9(34)正交试验,得到假苹婆树叶总黄酮得率,见表2。以下各个实验均在最佳温度70 ℃下进行。

表2 正交试验结果Table 2 Results of the orthogonal test

由表2、表3可知,各因素对总黄酮得率的影响大小顺序为:乙醇体积分数>提取时间>料液比>提取功率,乙醇体积分数对假苹婆总黄酮的提取影响极显著,提取时间有显著影响。假苹婆总黄酮的最佳提取条件为A3B2C3D1,即乙醇体积分数为60%,提取功率为60 W,提取时间为65 min,料液比为1∶25 (g/mL)。

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

为了进一步验证最优条件的可靠性,取上述最优条件进行三次平行试验,总黄酮得率为2.36%±0.0002%,提取率高于正交试验中的任意结果,符合最优条件。

2.3 回收率的测定

取1.0 mL最佳提取条件下得到的假苹婆提取液6份,分别加入到10 mL比色管中,在各比色管中再分别加入1.0 mg芦丁标准品,摇匀,静置15 min后测定吸光度,得到平均回收率为99.49%,RSD=2%,表明该方法准确可靠。

2.4 假苹婆树叶总黄酮清除羟自由基的能力

羟自由基是最活泼的自由基,同时也是毒性最大的自由基,研究黄酮类化合物对羟自由基的清除具有一定意义[19]。由图6可知,随着假苹婆树叶总黄酮提取液和抗坏血酸质量浓度的增大,清除羟自由基的能力增强。和抗坏血酸相比,假苹婆树叶总黄酮提取液对羟自由基的清除能力相对较弱。但当假苹婆树叶总黄酮的质量浓度为4.92 mg/mL时,清除率达到73.58%。

图6 假苹婆树叶总黄酮和抗坏血酸对羟自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of ascorbic acidtotal and flavonoids from Sterculia lanceolata at various concentrations on hydroxyl free radicals

3 结论

以假苹婆树叶为原料,采用超声波辅助提取假苹婆树叶中的黄酮类化合物,通过单因素和正交试验,得到较优的提取工艺条件为:乙醇体积分数为60%,提取功率为60 W,料液比为1∶25 (g/mL),70 ℃下提取65 min,该条件下总黄酮得率为2.36%±0.0002%。总黄酮提取液对羟自由基的清除率随着其浓度的增大而增大,当假苹婆树叶总黄酮的质量浓度为4.92 mg/mL时,清除率达到73.58%,表明假苹婆总黄酮对羟自由基具有较好的清除效果。回收率实验表明该方法准确可靠。